本文關(guān)鍵詞：生長(zhǎng)抑素對(duì)小鼠胰島移植過(guò)程中胰腺外分泌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

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【摘要】：第一部分Balb/C小鼠胰島、胰腺外分泌細(xì)胞分離、純化及功能檢測(cè)目的：Balb/c小鼠胰島的分離純化方法：采用逆行膽胰管灌注V型膠原酶的方法來(lái)消化分離Balb/C小鼠胰島,單一濃度梯度淋巴細(xì)胞分離液(10771)及倒置顯微鏡下手工篩選純化胰島,DTZ(雙硫腙)特異性染色監(jiān)測(cè)胰島產(chǎn)量及純度,臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算胰島細(xì)胞的活性,通過(guò)ELISA試劑盒計(jì)算胰島素刺激指數(shù)以檢測(cè)胰島功能。胰腺外分泌細(xì)胞體外功能檢測(cè),收集上清液ELISA法測(cè)定胰蛋白酶含量。結(jié)果：純化后的每只Balb/C小鼠可獲150左右個(gè)高質(zhì)量的胰島,活性及純度均大于90%,葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)表明胰島功能基本正常。胰腺外分泌細(xì)胞培養(yǎng)1h,4h后取上清液胰蛋白酶含量為(5.8±1.2) ng/ml, (7.3 ±1.0) ng/ml。結(jié)論：應(yīng)用本課題組成熟的實(shí)驗(yàn)方法,能夠獲得高純度、高質(zhì)量的胰島及胰腺外分泌細(xì)胞以滿足下一步胰島移植后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。第二部分：Balb/C糖尿病小鼠左腎被膜下純胰島移植及與胰腺外分泌細(xì)胞共同移植動(dòng)物模型的建立目的：掌握本課題組建立Balb/C糖尿病小鼠左腎被膜下純胰島移植及與胰腺外分泌細(xì)胞共同移植動(dòng)物模型的方法及探討研究胰腺外分泌細(xì)胞對(duì)移植胰島的損傷作用。方法：Balb/C雄性小鼠腹腔內(nèi)注射STZ(鏈脲佐菌素)誘導(dǎo)成為1型糖尿病小鼠。單純移植組(n=10)在每只受鼠左腎被膜下移植胰島細(xì)胞團(tuán)250個(gè),共同移植組(n=10)在每只受鼠左腎被膜上下兩極同步移植胰島細(xì)胞團(tuán)250個(gè)和等體積的胰腺外分泌細(xì)胞,移植術(shù)后持續(xù)監(jiān)測(cè)小鼠尾靜脈血糖的變化,一個(gè)月后左腎切除,免疫組織化學(xué)染色法觀測(cè)抗胰島素抗體及抗胰蛋白酶抗體的表達(dá)。結(jié)果：(1)胰島移植后,共同移植組較單純組血糖恢復(fù)正常時(shí)間延遲2-3天,兩組移植后的糖尿病小鼠血糖均逐步恢復(fù)正常。(2)單純及共同移植組在腎被膜下可見大量抗胰島素抗體陽(yáng)性顯色,證實(shí)為移植胰島。共同移植組胰島細(xì)胞團(tuán)周圍可見大量的抗胰蛋白酶抗體陽(yáng)性顆粒,而單純移植組未見明顯的陽(yáng)性顆粒。(3)胰腺外分泌細(xì)胞和胰島細(xì)胞團(tuán)共同移植后,證實(shí)胰腺外分泌細(xì)胞可釋放大量的胰蛋白酶損傷移植胰島的功能恢復(fù)。結(jié)論：(1)選取誘導(dǎo)糖尿病模型的小鼠體重量大于26g,以1.75mg/kg腹腔內(nèi)注射可以誘導(dǎo)糖尿病模型。(2)成功建立了胰島和胰腺外分泌細(xì)胞共同移植的動(dòng)物模型,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供前期動(dòng)物模型準(zhǔn)備工作。第三部分：生長(zhǎng)抑素對(duì)小鼠胰島移植過(guò)程中胰腺外分泌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制目的：探討生長(zhǎng)抑素如何減輕小鼠胰島移植過(guò)程中胰腺外分泌細(xì)胞對(duì)移植胰島的損傷及其促進(jìn)胰腺外分泌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法：(1)體外實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)選取雄性BALB/C小鼠30只,獲取胰島和胰腺外分泌細(xì)胞,隨機(jī)分組及短期共同培養(yǎng)后,采用流式細(xì)胞術(shù)儀檢測(cè)凋亡、測(cè)定上清液中胰蛋白酶含量及檢測(cè)胰島的胰島素含量和刺激指數(shù)、外分泌細(xì)胞及胰島細(xì)胞涂片后采用TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡和免疫組化測(cè)定P53蛋白。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：采用膽總管內(nèi)逆行灌注膠原酶的方法分別分離、純化胰腺外分泌細(xì)胞和胰島,分別在小鼠上下極同時(shí)移植胰島250個(gè)及與其體積胰腺外分泌細(xì)胞,成功建立40只胰島移植模型,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組術(shù)后腹腔注射生長(zhǎng)抑素10ng/g,對(duì)照組術(shù)后腹腔注射等量生理鹽水,持續(xù)測(cè)定血糖水平及觀察生命體征的變化。術(shù)后5天摘除小鼠左腎移植物,采用冰凍切片TUNEL染色檢測(cè)胰腺外分泌細(xì)胞凋亡,免疫組化SP技術(shù)測(cè)定移植物中的胰蛋白酶釋放量。結(jié)果：(1)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,胰島細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為(6.76±0.30)%和(6.21±0.40)%,兩組對(duì)較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；生長(zhǎng)抑素實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為(21.34±0.34)%和(15.76±0.40)%,兩組對(duì)較,實(shí)驗(yàn)組凋亡率明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(0.05)；(2)原代培養(yǎng)后上清液中胰蛋白酶的含量ELISA測(cè)定：純化胰島組上清液中胰蛋白酶濃度為(0.43±1.11)ng/ml,對(duì)照組為(5.03 ±1.20)ng/ml,后者明顯高于前者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(0.01);實(shí)驗(yàn)組上清液中胰蛋白酶濃度為(2.43±1.30)ng/ml,低于對(duì)照組,但高于純化胰島組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(0.05)；(3)原代培養(yǎng)后胰島素刺激指數(shù)的比較：純化胰島組胰島素刺激指數(shù)為3.85±1.20,對(duì)照組為1.55±1.12,前者明顯高于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(0.01);實(shí)驗(yàn)組胰島素釋放指數(shù)為2.53±1.10,低于純化胰島組,但高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；(4)胰腺外分泌細(xì)胞和胰島涂片的TUNEL結(jié)果分析：胰腺外分泌細(xì)胞凋亡指數(shù)：TUNEL結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組胰腺外分泌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(25.37±0.56)%,而對(duì)照組胰腺外分泌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(17.68±0.41)%,對(duì)照組明顯低于實(shí)驗(yàn)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；胰島細(xì)胞無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(5)細(xì)胞涂片免疫組化SP結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞呈棕褐色染色,實(shí)驗(yàn)組P53染色陽(yáng)性率為(10.65±0.45)%,對(duì)照組P53染色陽(yáng)性率為(8.32±0.30)%,兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)術(shù)后5天冰凍切片的TUNEL凋亡檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組小鼠的熒光著色的外分泌細(xì)胞明顯少于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組胰腺外分泌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(18.35±0.45)%,而對(duì)照組胰腺外分泌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(10.23±0.23)%,對(duì)照組明顯低于實(shí)驗(yàn)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；胰島細(xì)胞凋亡指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(7)術(shù)后5天胰蛋白酶免疫組化結(jié)果：對(duì)照組中胰島細(xì)胞周圍充斥有大量的深棕色的抗胰蛋白酶抗體陽(yáng)性顆粒,而實(shí)驗(yàn)組中未見明顯的深棕色顯色。對(duì)照組陽(yáng)性顆粒數(shù)為(80±4),實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性顆粒數(shù)為(15±3),兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：(1)生長(zhǎng)抑素可以誘導(dǎo)小鼠胰島移植過(guò)程中損傷的胰腺外分泌細(xì)胞凋亡,而對(duì)胰島細(xì)胞凋亡沒有影響。(2)生長(zhǎng)抑素可以通過(guò)誘導(dǎo)胰腺外分泌細(xì)胞凋亡,與凋亡調(diào)控基因P53的表達(dá)成正相關(guān)。(3)在胰島移植中應(yīng)用生長(zhǎng)抑素可明顯減輕小鼠胰腺外分泌細(xì)胞對(duì)胰島的損害。
【關(guān)鍵詞】：Balb/C小鼠 分離 純化 胰島 胰島細(xì)胞 胰腺外分泌細(xì)胞 1型糖尿病 共同移植 左腎被膜 生長(zhǎng)抑素 胰腺外分泌細(xì)胞 TUNEL 胰蛋白酶 凋亡
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1;R657.5
【目錄】：

• 個(gè)人簡(jiǎn)歷3-5
• 英文縮寫一覽表5-6
• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-17
• 前言17-20
• 第一部分：Balb/C小鼠胰島的分離、純化及功能檢測(cè)20-32
• 材料及方法20-28
• 結(jié)果28-30
• 討論30-31
• 結(jié)論31-32
• 第二部分：Balb/C糖尿病小鼠腎被膜下純胰島及與胰腺外分泌細(xì)胞移植動(dòng)物模型的建立32-45
• 材料與方法32-37
• 結(jié)果37-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 第三部分：生長(zhǎng)抑素對(duì)小鼠胰島移植過(guò)程中胰腺外分泌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制45-61
• 材料與方法45-51
• 結(jié)果51-57
• 討論57-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-63
• 綜述63-83
• 參考文獻(xiàn)75-83
• 致謝83-84
• 在校期間發(fā)表的有關(guān)論文84

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本文編號(hào)：984986