本文關(guān)鍵詞：尿酸酶基因工程菌的構(gòu)建與分泌表達(dá)

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【摘要】：尿酸是嘌呤分解代謝產(chǎn)物,部分動(dòng)物將尿酸通過尿酸酶(Uricase,EC1.7.3.3)的作用轉(zhuǎn)化為水溶性更好的尿囊素排出體外,由于人類在進(jìn)化過程中尿酸酶基因發(fā)生突變,因此,只能以尿酸的形式排出。尿酸排出體外有兩種途徑,一為通過腎臟排泄(約占排泄量的2/3),但是由于尿酸本身的水溶性有限,增加腎臟尿酸排泄通常易引起腎臟尿酸結(jié)石,更加重了對腎功能的損害;一是通過腸道排泄,腸道在排出尿酸中的作用正常情況下雖居于次要地位(約占排泄量的1/3),但是可降低通過腎臟排泄的副作用,主要通過采用蒙脫石吸附、活性炭吸附、腸道透析、進(jìn)食含高膳食纖維的食物等措施降低腸道尿酸水平,它們或具有降低腸腔尿酸濃度或具有阻止尿酸從腸道吸收入血,增加尿酸從糞便的排出進(jìn)而具有降血尿酸的效果,但是這幾個(gè)方法有局限性,不適合長期治療應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建尿酸酶基因工程菌,使尿酸酶持續(xù)表達(dá)并分泌到胞外,促使腸道尿酸轉(zhuǎn)化為尿囊素,不僅可阻止腸道尿酸吸收入血,也可加速血尿酸向腸道的擴(kuò)散,進(jìn)而達(dá)到降低血尿酸的作用,為探索高尿酸血癥新的治療手段提供依據(jù)。1.構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-28a-sUOX以產(chǎn)朊假絲酵母菌(中國普通微生物菌種保藏管理中心,CGMCC2.120)基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增尿酸酶編碼基因,同時(shí),以金黃色葡萄球菌(ATCC6538)基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein a,SPA)信號(hào)肽編碼基因。重新改造原核表達(dá)載體pET-28a,利用PCR技術(shù)刪除Lac O和LacI序列,便于不需誘導(dǎo)劑的作用表達(dá)尿酸酶,同時(shí)便于轉(zhuǎn)化至DH5α中。將尿酸酶編碼基因和SPA信號(hào)肽編碼基因通過DNA連接實(shí)驗(yàn)連接后克隆至pET-28a載體中,命名為pET-28a-sUOX,進(jìn)行測序。測序結(jié)果與GenBank查詢結(jié)果一致。2.尿酸酶的表達(dá)將測序正確的重組表達(dá)載體pET-28a-sUOX轉(zhuǎn)化到DH5α中,不需誘導(dǎo)劑的作用進(jìn)行目的蛋白表達(dá)。分別收集6h、9h、12h、15h、18h菌體離心收集上清液,經(jīng)硫酸銨沉淀,透析后經(jīng)鎳層析柱分離純化得到蛋白產(chǎn)朊假絲酵母菌尿酸酶。隨后測定其生物學(xué)活性同時(shí)用Bradford檢測法測定蛋白質(zhì)含量。其活性為2.99U/mg.
【關(guān)鍵詞】：尿酸酶 大腸埃希菌 分泌 持續(xù)表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R589.7
【目錄】：

• 符號(hào)說明4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-14
• 參考文獻(xiàn)12-14
• 第一部分 構(gòu)建尿酸酶基因工程菌14-27
• 1 材料與方法14-23
• 2 結(jié)果23-24
• 3 討論24-25
• 參考文獻(xiàn)25-27
• 第二部分 尿酸酶的表達(dá)27-33
• 1 材料與方法27-30
• 2 結(jié)果30
• 3 討論30-31
• 參考文獻(xiàn)31-33
• 全文總結(jié)33-34
• 文獻(xiàn)綜述34-40
• 參考文獻(xiàn)37-40
• 致謝40-41
• 碩士期間發(fā)表的論文41

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號(hào)：974847