本文關(guān)鍵詞：叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1對糖尿病腎病小鼠足細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響及機制研究

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【摘要】：背景糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一,其常見的臨床特征為進行性蛋白尿,腎臟足細胞損傷是引起蛋白尿的關(guān)鍵靶點。足細胞位于腎小球毛細血管外的基底膜外層。以往研究表明,足突分離和足細胞凋亡導(dǎo)致蛋白尿,但是,近期有研究發(fā)現(xiàn),蛋白尿發(fā)生明顯早于足細胞脫落凋亡。Liu等提出,在損傷早期,足細胞可經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelia mesenchymal transition,EMT),使足細胞具有運動性,而從基底膜脫落,使濾過屏障受到破壞。Sam認(rèn)為,足細胞經(jīng)歷EMT為一動態(tài)過程,從中阻斷其介導(dǎo)通路可逆轉(zhuǎn)足細胞EMT,及時終止足細胞損傷,從而為早期防治蛋白尿的發(fā)生,緩解糖尿病腎病進程提供新的方向。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(Forkhead transcription factor O1,FoxO1)在轉(zhuǎn)錄翻譯、抗氧化應(yīng)激、糖脂代謝等方面發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)DN大鼠腎皮質(zhì)FoxO1,可緩解腎小球病變,包括系膜細胞和足細胞損傷。高糖環(huán)境下,TGF-β/Smad信號通路激活,介導(dǎo)足細胞發(fā)生EMT,表現(xiàn)為上皮細胞標(biāo)志性蛋白nephrin表達降低,而間質(zhì)細胞標(biāo)志蛋白desmin表達升高,腎小球濾過屏障完整性受到破壞,進而出現(xiàn)蛋白尿,促進糖尿病腎病的發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn),在腎小管上皮細胞中,TGF-β/Smad/ILK激活促進小管上皮細胞發(fā)生EMT。本課題組研究發(fā)現(xiàn),腎小球系膜細胞中上調(diào)FoxO1,可抑制TGF-β通路,減少高糖狀態(tài)下系膜細胞過度合成細胞外基質(zhì)。然而,在不同細胞中,FoxO1對TGF-β通路的影響因細胞種類而異。因此,本研究推測,在小鼠足細胞中,FoxO1可能通過抑制TGF-β/Smad/ILK信號通路過度激活,減輕高糖誘導(dǎo)的足細胞EMT,從而緩解糖尿病腎病腎臟足細胞損傷。目的研究FoxO1對糖尿病腎病小鼠和高糖下足細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化及TGF-β/Smad/ILK傳導(dǎo)通路的影響,并對其機制進行探討。方法使用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法,將組成性激活突變型(Constitutively active,CA)FoxO1慢病毒載體(LV-CA-FoxO1)、FoxO1短發(fā)夾樣RNA慢病毒載體(LV-FoxO1-sh RNA)及空慢病毒載體(LV-NC)轉(zhuǎn)染入足細胞,并使用藥物干預(yù)TGF-β通路。細胞實驗分組為正常糖濃度組(NG組)和單純高糖(25mmol/L)組(HG組),將轉(zhuǎn)染LV-CA-FoxO1和LV-NC的足細胞培養(yǎng)于高糖(25mmol/L)環(huán)境下分為LV-CA-FoxO1組(CA組)和空病毒載體組(NC組),將轉(zhuǎn)染LV-FoxO1-sh RNA的足細胞分為LV-FoxO1-sh RNA組(sh RNA組)和分別使用藥物SIS3及QLT0267處理后分為SIS3組和QLT組。各組分別高糖處理72h、藥物處理12h后,實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測各組FoxO1、TGF-β1、Smad3、ILK、nephrin、desmin m RNA的表達水平;Western blotting法檢測FoxO1、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)、TGF-β1、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)、ILK、nephrin、desmin的蛋白水平;細胞免疫熒光化學(xué)法檢測FoxO1的表達及分布,酶聯(lián)免疫法(Elisa法)檢測上清中TGF-β1的分泌量。動物實驗部分:通過STZ誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠動物模型,使用靶向注射的方法將LV-CA-FoxO1及LV-NC注射入小鼠右側(cè)腎皮質(zhì)。糖尿病小鼠隨機分為3組:糖尿病未治療組(DM組),LV-CA-FoxO1治療組(CA組)及LV-NC組(NC組),以正常小鼠作為正常對照組(NG組)。8周末取材,抽取小鼠內(nèi)眥靜脈檢測血清肌酐、尿素氮;收集隨機尿檢測尿微量白蛋白和24小時尿檢測24小時尿總蛋白,實時熒光定量PCR檢測腎皮質(zhì)FoxO1、TGF-β1、Smad3、ILK、nephrin、desmin m RNA的表達水平;Western blotting法檢測FoxO1、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)、TGF-β1、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)、ILK、nephrin、desmin的蛋白水平;免疫組化檢測腎小球nephrin和desmin表達水平;HE染色及掃描、透射電鏡觀察腎臟病理學(xué)變化情況。結(jié)果1.各組FoxO1表達及活性改變:在各組足細胞中,與NG組相比,HG組、NC組FoxO1 m RNA及蛋白表達無明顯變化(P0.05),CA組較HG組FoxO1m RNA及蛋白表達升高(P0.05)。HG組較NG組p-FoxO1/FoxO1水平升高(P0.05),轉(zhuǎn)錄活性下降;CA組p-FoxO1/FoxO1水平降低(P0.05),與NG組相比,sh RNA組、SIS3組QLT組FoxO1 m RNA及蛋白表達減少(均P0.05),p-FoxO1/FoxO1無變化(P0.05)。在足細胞細胞免疫熒光中NG組、HG組和NC組總紅色熒光強度無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),與NG組相比,HG組細胞核中FoxO1紅色熒光減弱,胞質(zhì)中相對增多(均P0.05)。與HG組相比,CA組細胞總紅色熒光強度增強,核中與細胞總熒光強度比值增加(均P0.05)。與NG組相比,sh RNA組總紅色熒光強度減弱,胞核與細胞總紅色熒光強度比值無統(tǒng)計學(xué)差異(均P0.05)。2.FoxO1對TGF-β1/Smad3/ILK信號通路的影響:與NG組相比,HG組TGF-β1、Smad3和ILK m RNA及蛋白表達均升高(均P0.05)。與HG組相比,CA組TGF-β1和ILK m RNA及蛋白表達減少,p-Smad3/Smad3升高(均P0.05),而Smad3 m RNA及蛋白表達無差異(P0.05);相比較NG組,sh RNA組中TGF-β1、Smad3和ILK m RNA及蛋白表達均升高,且p-Smad3/Smad3增大(均P0.05)。與sh RNA組相比,SIS3組p-Smad3/Smad3降低,且ILK m RNA及蛋白表達減少(均P0.05),而QLT組僅表現(xiàn)為ILK表達減少(P0.05),通路中其他指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(均P0.05)。3.FoxO1對足細胞上皮標(biāo)志蛋白nephrin及間質(zhì)標(biāo)志蛋白desmin的影響:HG組與NG組相比,nephrin m RNA及蛋白表達降低,desmin m RNA及蛋白表達升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05);與HG組相比,CA組nephrin m RNA及蛋白表達升高,desmin m RNA及蛋白表達降低(均P0.05)。與NG組相比,sh RNA組nephrin m RNA及蛋白表達降低,desmin m RNA及蛋白表達升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。與sh RNA組相比,SIS3組和QLT組nephrin m RNA及蛋白表達升高,desmin m RNA及蛋白表達降低(均P0.05)。NC組與HG組nephrin、desmin m RNA及蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異(均P0.05)。4.各組小鼠腎小球FoxO1表達:在NG、DM和NC組小鼠腎小球中FoxO1m RNA和蛋白無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),CA組中FoxO1 m RNA和蛋白表達增多(P0.05)。與NG組相比,DM組p-FoxO1/FoxO1比值升高(P0.05)。與DM組相比,CA組p-FoxO1/FoxO1比值降低(P0.05)。5.各組小鼠腎小球中FoxO1抑制TGF-β1/Smad3/ILK信號通路的激活:與NG組相比,DM組TGF-β1、Smad3和ILK m RNA和蛋白表達增多,p-Smad3/Smad3比值增大(均P0.05),TGF-β1/Smad3/ILK信號通路激活。與DM組相比,CA治療組TGF-β1和ILK m RNA和蛋白表達減少(均P0.05),Smad3 m RNA和蛋白表達無變化(P0.05),但是p-Smad/Smad3比值降低(P0.05)。6.FoxO1緩解糖尿病腎病小鼠足細胞EMT:與NG組相比,DM組上皮細胞標(biāo)志蛋白nephrin m RNA及蛋白表達降低,間質(zhì)細胞標(biāo)志蛋白desmin m RNA及蛋白表達升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05);與DM組相比,CA治療組nephrin m RNA及蛋白表達升高,desmin m RNA及蛋白表達降低(均P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,在糖尿病小鼠腎臟腎小球中,nephrin表達減少,desmin表達增多(均P0.05),而經(jīng)LV-CA-FoxO1治療后,nephrin表達增多,desmin表達減少(均P0.05)。7.FoxO1過表達緩解糖尿病小鼠腎臟損傷:與NG組比較,糖尿病未治療組及LV-CA-FoxO1、LV-NC治療組血糖水平明顯升高。8周末,DM組血清肌酐、尿素氮和尿微量白蛋白、24 h尿蛋白水平較NG組明顯升高(均P0.05),CA治療后血清肌酐、尿素氮和尿微量白蛋白、24 h尿蛋白水平明顯降低(均P0.05)。HE染色光鏡觀察顯示NG組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)整齊,無明顯異常。DM組小鼠腎小球體積明顯增大,基底膜異常增厚。透射電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示NG組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰,基底膜均勻,無增厚,足細胞胞體飽滿,足突排列整齊,DM組大鼠腎小球基底膜明顯增厚,且厚薄不均一,足細胞胞體足突融合、缺失。結(jié)論1.高糖下足細胞FoxO1轉(zhuǎn)錄活性降低,導(dǎo)致足細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。2.過表達FoxO1可抑制高糖誘導(dǎo)的足細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,改善足細胞功能紊亂,其機制可能與抑制TGF-β1/Smad3/ILK通路過度激活有關(guān)。3.糖尿病腎病小鼠足細胞可發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,可能與FoxO1轉(zhuǎn)錄活性降低有關(guān)。腎臟過表達FoxO1可緩解足細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,減輕蛋白尿,延緩糖尿病腎病的發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1 糖尿病腎病 足細胞 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化 轉(zhuǎn)化生長因子β1 Smad3蛋白家族 整合素激酶
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 摘要4-9
• Abstract9-16
• 中英文縮略詞16-18
• 前言18-21
• 1 材料與方法21-33
• 2 結(jié)果33-37
• 3 討論37-40
• 4 結(jié)論40-41
• 附圖41-47
• 參考文獻47-50
• 綜述 足細胞損傷與糖尿病腎病的研究進展50-70
• 參考文獻62-70
• 個人簡歷70-71
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果71-72
• 致謝72-73

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7 姜e

本文編號：958924