本文關(guān)鍵詞：高脂血癥對(duì)小鼠拔牙創(chuàng)早期愈合過(guò)程的影響及其分子調(diào)控機(jī)制的初步研究

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【摘要】：目的全身系統(tǒng)狀況會(huì)影響拔牙創(chuàng)的愈合過(guò)程。研究表明,高脂血癥不僅是導(dǎo)致心血管疾病的高危因子,還可通過(guò)影響成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的分化積極參與骨改建的進(jìn)程。然而,目前關(guān)于高脂血癥微環(huán)境是否會(huì)影響拔牙創(chuàng)的愈合過(guò)程尚未見(jiàn)明確的研究報(bào)道。另外,雖然已有一些研究報(bào)道了高脂血癥抑制成骨細(xì)胞分化的分子生物學(xué)機(jī)制,仍有大片的未知領(lǐng)域等待進(jìn)一步的探索。作為Wnt經(jīng)典信號(hào)通路特異性受體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制因子,分泌型卷曲相關(guān)蛋白1 (secreted frizzled-related protein 1, SFRP1)可通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)經(jīng)典通路在骨代謝過(guò)程中起至關(guān)重要的調(diào)控作用。但目前尚不清楚高脂血癥對(duì)骨代謝的調(diào)控功能是否可通過(guò)調(diào)控SFRP1實(shí)現(xiàn)。為明確高脂血癥對(duì)拔牙創(chuàng)愈合過(guò)程的影響,并初步探索其分子生物學(xué)機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)擬選取C57BL/6小鼠和載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠),通過(guò)高脂飲食飼養(yǎng)建立高脂血癥小鼠模型,并在自然愈合的條件下,觀察高脂血癥對(duì)拔牙創(chuàng)愈合過(guò)程的影響。同時(shí),構(gòu)建編碼SFRP1基因3’非編碼區(qū)(untranslated regions, UTR)的熒光素酶表達(dá)載體,擬用于后續(xù)研究明確高脂血癥微環(huán)境下SFRP1對(duì)成骨細(xì)胞的分子調(diào)控是否受到影響。方法第一部分：選用6周齡雄性C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠,將小鼠隨機(jī)分為C57BL/6正常飲食組(WT+S), C57BL/6高脂飲食組(WT+HFD), ApoE-/-正常飲食組(ApoE+S)和ApoE-／-高脂飲食組(ApoE+HFD)四組。分別經(jīng)正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)4周后,經(jīng)內(nèi)眥取血檢測(cè)血脂水平。在喂養(yǎng)5周后,拔除小鼠雙側(cè)下領(lǐng)第2磨牙和第3磨牙。分別在拔牙后第1周和第2周處死小鼠,內(nèi)眥取血進(jìn)行血脂水平檢測(cè),并分離下頜骨進(jìn)行HE染色和亞甲藍(lán)染色用于組織學(xué)測(cè)量,評(píng)價(jià)新骨形成量及牙槽嵴頂下降高度。第二部分：使用含50 mg/L抗壞血酸的成骨誘導(dǎo)液分別處理MC3T3-E1細(xì)胞0、7、10天。提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測(cè)細(xì)胞中SFRP1基因的mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞蛋白質(zhì),以p-肌動(dòng)蛋白(p-actin)為內(nèi)參,使用蛋白質(zhì)印跡法(western blot, WB)檢測(cè)細(xì)胞中SFRP1蛋白的表達(dá)水平。使用PCR技術(shù)克隆SFRP1基因的YUTR區(qū)并連接到熒光素酶報(bào)告基因載體pMIR-REPORT上。所構(gòu)建的新載體命名為pMIR-REPORT-SFRP1UTR.分別將pMIR-REPORT-SFRP 1 UTR和pMIR-REPORT轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞中,檢測(cè)細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)水平。結(jié)果第一部分：喂養(yǎng)4周后,血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示W(wǎng)T+HFD組血漿中總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-c)的濃度分別是WT+S組的2.2(p0.05)、1.87(p0.05)和1.54(正0.05)倍。而ApoE+HFD組血漿中TC、TG和LDL-c的濃度是ApoE+S組的2.06(p0.05)、3.51(p0.05)和2.52(p0.05)倍。拔牙后1周和2周時(shí),血脂水平的檢測(cè)結(jié)果顯示出類(lèi)似的變化。另外,拔牙后1周時(shí)WT+HFD組的新骨形成率低于WT+S組,且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而ApoE+HFD組新骨形成率雖然略低于ApoE+S組,但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。拔牙后2周時(shí),WT+HFD組的新骨形成率顯著低于WT+S組(p0.05),而ApoE+HFD組的新骨形成率也顯著低于ApoE+S組(p0.05)。通過(guò)測(cè)量牙槽嵴頂高度降低的程度,我們發(fā)現(xiàn)在拔牙后1周和2周時(shí),WT+HFD組的舌側(cè)牙槽嵴頂降低程度均顯著大于WT+S組(p0.05),而ApoE+HFD組的舌側(cè)牙槽嵴頂降低程度也都大于ApoE+S組,且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(正0.05)。第二部分：成骨誘導(dǎo)0、7及10天后,細(xì)胞中SFRP1的mRNA水平分別為1.00±0.12、1.97±0.34和5.00±0.99,誘導(dǎo)10天與0天相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。成骨誘導(dǎo)0、7及10天后,細(xì)胞中SFRP1的蛋白水平分別為0.944±0.13、1.26±0.16及1.30±0.15, 誘導(dǎo)7、10天與0天相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。MC3T3-E1細(xì)胞中,pMIR-REPORT轉(zhuǎn)染組和pMIR-REPORT-SFRP1UTR轉(zhuǎn)染組的熒光素酶表達(dá)量分別為487±34和744±10,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。NIH3T3細(xì)胞中,pMIR-REPORT轉(zhuǎn)染組和pMIR-REPORT-SFRP1UTR轉(zhuǎn)染組的熒光素酶表達(dá)量分別為2707±117和2240±175,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論第—部分：成功在C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠上建立了飲食干預(yù)的高脂血癥小鼠模型。高脂血癥抑制了小鼠拔牙創(chuàng)新骨的形成,延遲了骨愈合,同時(shí)促進(jìn)了牙槽骨的吸收,加劇了拔牙后的骨喪失。第二部分： 成功構(gòu)建了編碼SFRP1基因YUTR區(qū)的熒光素酶表達(dá)載體。SFRP1基因的YUTR區(qū)參與了SFRP1基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,且這種調(diào)控具有一定的細(xì)胞特異性。
【關(guān)鍵詞】：高脂血癥 拔牙創(chuàng) SFRP1 3'UTR Wnt信號(hào)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R782.11;R589.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 中英文縮略詞對(duì)照表12-13
• 前言13-19
• 第一部分 高脂血癥對(duì)小鼠拔牙創(chuàng)早期骨愈合的影響19-32
• 材料和方法19-24
• 結(jié)果24-27
• 討論27-31
• 結(jié)論31-32
• 第二部分 小鼠成骨細(xì)胞中分泌型卷曲相關(guān)蛋白1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的研究32-46
• 材料和方法32-40
• 結(jié)果40-42
• 討論42-45
• 結(jié)論45-46
• 小結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-55
• 致謝55-56
• 附錄56-57
• 學(xué)位論文評(píng)閱及況表57

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本文編號(hào)：930497