本文關(guān)鍵詞：下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)肽Y表達(dá)缺失對(duì)大鼠脂肪組織脂代謝的影響研究

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【摘要】：研究背景肥胖及肥胖相關(guān)性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康,已成為全世界亟待解決的課題。人類和哺乳動(dòng)物體內(nèi),白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)主要司儲(chǔ)存能量,棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)增強(qiáng)非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱、增加胰島素敏感性,改善胰島素抵抗。成年嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)肩胛間區(qū)存在棕色脂肪組織,而腹股溝區(qū)、附睪、內(nèi)臟脂肪組織則為白色脂肪組織。在一定干預(yù)條件下,白色脂肪組織可以發(fā)生棕色樣改變。PR結(jié)構(gòu)域家族的第16個(gè)成員PRDM16(PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain containing 16)是BAT中高表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,在棕色脂肪細(xì)胞分化過程中起正向調(diào)節(jié)作用,參與誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體數(shù)量增多和功能增強(qiáng),增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化,加速能量消耗和熱量生成。Ⅱ型脫碘酶(TypeⅡiodothyronine deiodinase,Dio-2)是棕色脂肪組織的分子標(biāo)志之一,在棕色脂肪細(xì)胞可通過與解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)的基因特異位點(diǎn)結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)能量代謝。下丘腦在維持能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)是一種重要的促食欲肽,對(duì)攝食的調(diào)節(jié)多依賴于下丘腦中的NPY神經(jīng)元,在下丘腦,NPY存在于弓狀核、背內(nèi)側(cè)核等區(qū)域,以弓狀核含量最豐富。研究顯示,特異性敲除高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠下丘腦弓狀核NPY基因可改善肥胖大鼠的能量代謝。成纖維細(xì)胞生長因子-21(fibroblast growth factor-21,FGF21)可表達(dá)于肝臟、脂肪組織和胰腺等器官和組織(嚙齒類動(dòng)物),通過形成FGF21/b-Klotho/FGFR復(fù)合體發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng),改善糖脂代謝。FGF21經(jīng)交感神經(jīng)系統(tǒng)誘導(dǎo)WAT中出現(xiàn)米色或棕色脂肪細(xì)胞。而下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)肽Y表達(dá)缺失與脂肪組織內(nèi)脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平(如PRDM16、Dio-2、FGF21)的關(guān)系,尚未見明確報(bào)道。目的建立下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)肽Y表達(dá)缺失的大鼠動(dòng)物模型,并給予高脂飲食干預(yù),探討大鼠的體重改變和脂肪組織脂代謝相關(guān)基因PRDM16、Dio-2和FGF21表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)方法建立動(dòng)物模型:4-5周齡雄性清潔級(jí)SD大鼠80只,其中體重為270-300g的大鼠20只,體重為130-150g的大鼠60只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,構(gòu)建腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)介導(dǎo)的帶有熒光標(biāo)記的RNAi(RNA interference)重組轉(zhuǎn)運(yùn)體(AAVsh NPY及AAVsh CTL),病毒滴度為1×109particles/site。其中AAVsh NPY導(dǎo)致表達(dá)缺失,AAVsh CTL是作為對(duì)照的空載體。用270-300g的大鼠驗(yàn)證建模是否成功,根據(jù)Paxinos和Watson大鼠腦圖譜定位DMH的位置。隨機(jī)選取15只分別接受雙側(cè)DMH的AAVsh NPY注射,并在注射病毒的1、2和4周后(每周隨機(jī)選取5只)處死,再隨機(jī)選取5只分別接受雙側(cè)DMH的AAVsh CTL注射,注射4周后處死。處死后迅速取下丘腦,一部分置于液氮中保存,制作冰凍切片觀察轉(zhuǎn)染位置,一部分制作石蠟切片應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)檢測DMH NPY m RNA的表達(dá),確定病毒重組體能夠敲除DMH NPY即建模成功;將余60只大鼠隨機(jī)均分為兩組,根據(jù)Paxinos和Watson大鼠腦圖譜定位DMH的位置。上述兩組分別接受雙側(cè)DMH的AAVsh NPY(AAVsh NPY組)及AAVsh CTL空載體(AAVsh CTL組)注射,完成動(dòng)物模型的建立。每周1次于固定時(shí)間對(duì)各組大鼠進(jìn)行稱重并記錄。實(shí)驗(yàn)1~4周所有大鼠給予常規(guī)飲食(regular chow,RC),第5周再從AAVsh NPY組及AAVsh CTL組各自隨機(jī)選取一半大鼠給予高脂飲食(high fat diet,HF),其余大鼠仍給予常規(guī)飲食,此時(shí)所有大鼠被分為AAVsh NPY HF組、AAVsh NPY RC組、AAVsh CTL HF組、AAVsh CTL RC組。注射病毒16周后處死大鼠,采集腹股溝區(qū)和附睪脂肪組織,液氮保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time PCR)法測定大鼠腹股溝區(qū)和附睪脂肪組織FGF21m RNA、PRDM16m RNA、Dio-2 m RNA的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot,WB)測定大鼠腹股溝區(qū)和附睪脂肪組織中PRDM16蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1成功建立下丘腦背內(nèi)側(cè)核NPY表達(dá)缺失的動(dòng)物模型攜帶紅色熒光的病毒成功注入下丘腦背內(nèi)側(cè)核,注射后,AAVsh NPY組的NPY m RNA表達(dá)水平低于AAVsh CTL組,分別將注射1、2、4周后AAVsh NPY組與AAVsh CTL組比較,均有顯著差異(P(27)0.05)。2大鼠體重增加量第5周添加高脂飲食前AAVsh NPY組與AAVsh CTL組比較,有顯著差異(P(27)0.05),提示DMH NPY缺失已開始導(dǎo)致體重增速減緩;第16周末:與常規(guī)飲食組大鼠相比,高脂飲食組大鼠體重增加顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(27)0.01),提示高脂飲食誘導(dǎo)大鼠體重增長迅速;與AAVsh CTL組相比,AAVsh NPY組體重增長量明顯較低,有顯著差異(P(27)0.01),提示DMH NPY缺失可引起體重增長緩慢。3實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果腹股溝區(qū)和附睪脂肪組織FGF21m RNA的表達(dá)均呈現(xiàn)以下特征:AAVsh CTL組與AAVsh NPY組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(29)0.05),提示DMH NPY敲除對(duì)脂肪組織FGF21表達(dá)無影響;與RC組相比,HF組大鼠均呈現(xiàn)低表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(27)0.01),提示高脂飲食降低脂肪組織FGF21的表達(dá)。各組大鼠附睪脂肪組織中PRDM16和Dio-2 m RNA的表達(dá)水平均較低,兩者的組間兩兩比較提示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(29)0.05)。提示DMH NPY表達(dá)缺失和高脂飲食對(duì)附睪脂肪組織PRDM16、Dio-2 m RNA的表達(dá)均無影響。腹股溝區(qū)脂肪組織PRDM16和Dio-2 m RNA的表達(dá)一致,如下:與AAVsh CTL相比,AAVsh NPY組的表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(27)0.01),提示DMH NPY敲除引起PRDM16和Dio-2 m RNA高表達(dá);與RC組相比,HF組表達(dá)水平下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(27)0.01),提示高脂飲食誘導(dǎo)PRDM16和Dio-2 m RNA表達(dá)下降。4 Western blot結(jié)果與AAVsh CTL高脂飲食組相比,AAVsh NPY高脂飲食組腹股溝區(qū)脂肪組織PRDM16蛋白高表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(27)0.01);與AAVsh CTL常規(guī)飲食組相比,AAVsh CTL高脂飲食組腹股溝區(qū)脂肪組織PRDM16蛋白低表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(27)0.01)。而附睪脂肪組織中,組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(29)0.05)。與RT-PCR檢測結(jié)果一致。結(jié)論1.下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)肽Y表達(dá)缺失能上調(diào)大鼠腹股溝區(qū)脂肪組織棕色脂肪相關(guān)基因PRDM16和Dio-2的表達(dá),改善脂代謝,緩解高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。2.高脂飲食可引起大鼠脂肪組織FGF21的表達(dá)下調(diào),且敲除下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)肽Y對(duì)FGF21的表達(dá)無調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：下丘腦背內(nèi)側(cè)核 成纖維細(xì)胞生長因子-21 肥胖癥 棕色脂肪組織 神經(jīng)肽Y
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R589.2
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞14-16
• 引言16-18
• 材料與方法18-33
• 結(jié)果33-40
• 討論40-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-47
• 綜述 下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)肽Y與肥胖的相關(guān)研究進(jìn)展47-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 個(gè)人簡介和獲獎(jiǎng)情況及在校期間發(fā)表的論文63-64
• 致謝64

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本文編號(hào)：904976