本文關(guān)鍵詞：ERK5信號(hào)通路在雌激素抑制TNF-α誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的:雌激素缺乏與骨量丟失密切相關(guān),且能影響骨組織的力學(xué)響應(yīng)能力。雌激素骨保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不十分明確,對(duì)這一機(jī)制的研究有助于揭示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制,并為其治療提供新思路、新靶點(diǎn)。本課題以ERK5分子為核心,研究雌激素抑制成骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制,結(jié)果將為骨量減少性疾病治療藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。方法:(一)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):隨機(jī)將15只6周齡(性成熟)的雌性昆明小鼠分為5組,每組3只,隨機(jī)選取4組行雙側(cè)卵巢切除手術(shù),另外一組行假手術(shù)并作為對(duì)照。術(shù)后3天開(kāi)始給予不同藥物干預(yù),對(duì)照組平行喂養(yǎng),切除卵巢的4組中,一組平行喂養(yǎng),一組每日按50mg/kg體重的劑量腹腔注射ERK5特異性阻斷劑XMD8-92一次,一組每日按5mg/kg體重的劑量皮下注射17β-雌二醇一次,一組每日分別按50mg/kg、5mg/kg體重的劑量腹腔注射XMD8-92并皮下注射17β-雌二醇各一次,每周行雙能X線骨密度檢查監(jiān)測(cè)股骨骨密度的變化情況,當(dāng)單純摘除卵巢組骨密度下降至與初始值相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)終止實(shí)驗(yàn),麻醉下頸椎脫臼法處死小鼠收集股骨標(biāo)本,每組樣本經(jīng)固定后對(duì)股骨遠(yuǎn)端干骺端部位分別行Micro-CT掃描和組織學(xué)檢查。(二)體外實(shí)驗(yàn):首先對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠源性MC3T3-E1成骨細(xì)胞分別孵育不同時(shí)間和不同濃度的17β-雌二醇,通過(guò)Western-Blot研究雌激素活化ERK5的規(guī)律,明確最佳激活濃度及時(shí)間。再通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst33258染色及TUNEL/DAPI復(fù)染研究不同干預(yù)條件下成骨細(xì)胞的凋亡情況,明確ERK5在成骨細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中的作用。最后通過(guò)Western-Blot及酶標(biāo)儀檢測(cè)不同干預(yù)條件下成骨細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)量的差異,明確ERK5在成骨細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中的具體作用機(jī)制。結(jié)果:(一)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):骨密度監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,在最初的一段時(shí)間內(nèi),各組骨密度變化均不明顯,各組間也沒(méi)有明顯差異。隨著時(shí)間的推移和用藥的繼續(xù),各組小鼠骨密度開(kāi)始出現(xiàn)較明顯的變化趨勢(shì),組間差異也逐漸變得明確。8周后終止實(shí)驗(yàn),單純摘除卵巢組小鼠骨密度較初始值及對(duì)照組分別降低38.07%和37.06%;而切除卵巢后腹腔注射ERK5特異性阻斷劑XMD8-92組小鼠骨密度較對(duì)照組降低47.89%,更較單純摘除卵巢組小鼠骨密度低17.21%;切除卵巢后外源性補(bǔ)充雌激素組小鼠骨密度較單純摘除卵巢組小鼠骨密度增高151.78%,甚至比對(duì)照組小鼠骨密度增加55.92%;摘除卵巢后先注射XMD8-92阻斷ERK5活化再外源性補(bǔ)充雌激素組小鼠骨密度較單純外源性補(bǔ)充雌激素組降低32.45%。Micro-CT掃描及三維重建結(jié)果顯示,同對(duì)照組相比,切除卵巢后小鼠骨小梁體積、數(shù)目及厚度分別減少30.45%、42.30%和17.81%,小梁間隙增寬35.89%;卵巢切除后與ERK5特異性阻斷劑XMD8-92聯(lián)合干預(yù)下小鼠骨小梁數(shù)目更少,體積及厚度也更小,小梁間隙更寬;卵巢切除后給予外源性補(bǔ)充17β-雌二醇組骨小梁體積、數(shù)目及厚度分別較單純摘除卵巢組增加310.50%、196.91%和323.39%,小梁間隙減少81.95%;而在卵巢切除同時(shí)給予XMD8-92和雌激素干預(yù)組小鼠骨小梁體積、數(shù)目及厚度較單獨(dú)給予雌激素干預(yù)時(shí)分別減少62.42%、38.71%和65.55%,小梁間隙增加185.20%。HE染色結(jié)果與骨密度監(jiān)測(cè)及Micro-CT掃描結(jié)果一致。(二)體外實(shí)驗(yàn):對(duì)小鼠源性MC3T3-E1成骨細(xì)胞孵育10(-6)mol/L的17β-雌二醇,隨孵育時(shí)間延長(zhǎng),ERK5活化水平增加,在15min時(shí)達(dá)到高峰(77.80±7.70%),之后迅速降低;用不同濃度的17β-雌二醇(10(-9)-10(-5)mol/L)分別孵育成骨細(xì)胞15min,發(fā)現(xiàn)ERK5活化水平隨17β-雌二醇濃度的增加而增加,在10(-6)mol/L已達(dá)高峰(52.16±8.87%);5umol/L的XMD8-92孵育1h能有效阻斷ERK5的磷酸化。流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,40ng/ml的TNF-α能有效誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡(49.10±5.29%),10(-6)mol/L的17β-雌二醇孵育15min有效刺激ERK5活化并顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的凋亡率(14.51±3.04%),XMD8-92阻斷雌激素對(duì)ERK5的活化后TNF-α誘導(dǎo)的凋亡率升至48.29±6.33%。Hoechst33258染色及TUNEL/DAPI復(fù)染結(jié)果類似。進(jìn)一步的Western-Blot及酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果顯示,TNF-α作用下成骨細(xì)胞Bax表達(dá)增加,Bcl-2表達(dá)減少,Bax/Bcl-2比例增加,Caspase3活性增加;17β-雌二醇預(yù)處理刺激ERK5活化后Bax表達(dá)減少,Bcl-2表達(dá)增加,Bax/Bcl-2比例減小,Caspase3活性降低;XMD8-92阻斷雌激素對(duì)ERK5的活化后Bax表達(dá)增加,Bcl-2表達(dá)減少,Bax/Bcl-2比例增加,Caspase3活性增加。結(jié)論:1.ERK5信號(hào)通路參與雌激素的骨保護(hù)作用,與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展有關(guān);2.雌激素以時(shí)間、濃度依賴的方式激活成骨細(xì)胞內(nèi)ERK5后,通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá),下調(diào)Bax表達(dá),增加Bcl-2/Bax比例,進(jìn)而抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),抑制TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(ERK5) 雌激素 腫瘤壞死因子α(TNF-α) 成骨細(xì)胞 凋亡
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R580
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一部分 ERK5信號(hào)通路在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中作用的研究10-19
• 1.1 前言10-11
• 1.2 材料與方法11-13
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料11-12
• 1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法12-13
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果13-18
• 1.3.1 XMD8-92加劇絕經(jīng)后骨量減少并影響雌激素的骨保護(hù)作用過(guò)程13-15
• 1.3.2 OVX/XMD8-92/E2處理后股骨樣本Micro-CT掃描及三維重建結(jié)果15-17
• 1.3.3 OVX/XMD8-92/E2處理后股骨樣本HE染色結(jié)果17-18
• 1.4 小結(jié)18-19
• 第二部分 ERK5信號(hào)通路在雌激素抑制TNF-α 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中作用的研究19-34
• 2.1 前言19-20
• 2.2 材料與方法20-27
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-32
• 2.3.1 17β -雌二醇對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)ERK5的活化作用27-28
• 2.3.2 XMD8-92對(duì) 17β - 雌二醇激活成骨細(xì)胞內(nèi)ERK5的阻斷作用28
• 2.3.3 成骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)28-32
• 2.4 小結(jié)32-34
• 第三部分 ERK5信號(hào)通路在雌激素抑制TNF-α 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中作用機(jī)制的研究34-45
• 3.1 前言34-35
• 3.2 材料與方法35-39
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料35-37
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法37-39
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-43
• 3.3.1 XMD8-92上調(diào)成骨細(xì)胞中Bax/Bcl-2 比例39-40
• 3.3.2 XMD8-92促進(jìn)TNF-α 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中Bax/Bcl-2 比例上調(diào)40
• 3.3.3 XMD8-92抑制 17β -雌二醇誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中Bax/Bcl-2 比例下調(diào)40-41
• 3.3.4 在TNF-α 作用下XMD8-92抑制 17β -雌二醇誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中Bax/Bcl-2 比例下調(diào)41-42
• 3.3.5 17β -雌二醇抑制TNF-α 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中Caspase3活性改變42-43
• 3.4 小結(jié)43-45
• 第四部分 討論45-53
• 第五部分 結(jié)論53-54
• 研究展望54-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 中英文對(duì)照表62-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間主要研究成果64-65
• 致謝65

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本文編號(hào)：901902