本文關(guān)鍵詞：培養(yǎng)、擴增及動員糖尿病鼠循環(huán)纖維細(xì)胞的實驗研究

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【摘要】：第一部分正常小鼠和糖尿病小鼠循環(huán)纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的比較[目的]慢性創(chuàng)面的細(xì)胞治療是當(dāng)前創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)的研究熱點之一。本實驗通過采集c57小鼠和基因自發(fā)突變db/db糖尿病小鼠外周血單個核細(xì)胞,進行循環(huán)纖維細(xì)胞體外培養(yǎng),觀察其體外增殖活性,旨在為創(chuàng)面的細(xì)胞治療提供可靠的細(xì)胞,為后續(xù)開展促進糖尿病創(chuàng)面愈合的動物實驗研究提供依據(jù)打下基礎(chǔ)。[方法]密度梯度離心法收集c57小鼠和db/db糖尿病小鼠外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)根據(jù)所查文獻(xiàn)及前期實驗,調(diào)整細(xì)胞密度,平鋪接種于20%胎牛血清+1%的高糖DMEM+0.5%雙抗鏈霉素、青霉素配制的培養(yǎng)液中,然后連續(xù)觀察培養(yǎng),每間隔2-3天給予更換細(xì)胞培養(yǎng)液,換液時除給予室溫PBS漂洗之外,不做任何其它處理。分別對細(xì)胞接種后當(dāng)天、第3、5、7、10天于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖克隆以及形態(tài)變化,并通過數(shù)碼相機采集圖片。細(xì)胞培養(yǎng)后對c57小鼠和db/db糖尿病小鼠循環(huán)纖維細(xì)胞同一時間點細(xì)胞形態(tài)、增殖活性進行觀察,有無區(qū)別,并對其分離成功率、cfb獲得率及增殖活性進行觀察。[結(jié)果]在體外cFb分離培養(yǎng)過程中,先后約30份糖尿病小鼠肝素抗凝血標(biāo)本和38份c57小鼠肝素抗凝血標(biāo)本成功納入本次實驗。對其分離成功率、cFb獲得率及增殖活性進行統(tǒng)計,結(jié)果顯示：糖尿病小鼠分離PBMCs17份(57%),獲得cFb10份(33%)；而c57分離PBMCs28份(73%),獲得cFb18份(47%)。對培養(yǎng)后獲得的貼壁梭形細(xì)胞樣細(xì)胞進行體外增殖活性觀察顯示,c57小鼠cFb體外培養(yǎng)5-7天細(xì)胞融合率可達(dá)約60%,而糖尿病小鼠cFb的體外增殖活性則明顯延遲,需在體外培養(yǎng)10至14天細(xì)胞融合率才能達(dá)到約50%,在相差顯微鏡下觀察,兩組間細(xì)胞形態(tài)未見明顯差異。[結(jié)論]1、糖尿病小鼠外周血液來源的cFb在獲得成功率、增殖活性等方面均低于c57小鼠；2、無論是正常小鼠還是糖尿病小鼠,雖然體外擴增可以獲得成功,但總體結(jié)果還不穩(wěn)定,尚不能獲得理想數(shù)量的循環(huán)纖維細(xì)胞。[目的]在前期研究的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)糖尿病狀態(tài)下外周血循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)目較少,體外培養(yǎng)困難,為增加探外周血cFb數(shù)量,以提高糖尿病外周血cFb體外培養(yǎng)、擴增成功率,本階段實驗通過動員自體骨髓循環(huán)纖維細(xì)胞,并對動員后不同時間點外周血中循環(huán)纖維細(xì)胞的數(shù)量進行觀察比較,從而優(yōu)選動員方法和采集細(xì)胞時機,旨在為cFb體外培養(yǎng)、擴增提供穩(wěn)定、足量的細(xì)胞來源,為后續(xù)創(chuàng)面治療研究打下基礎(chǔ),為臨床開展慢性創(chuàng)面的細(xì)胞治療提供新的方向和思路。[方法]采用10～11周齡自發(fā)突變糖尿病C57BL/KsJ (db/db)小鼠60只,隨機分為A組(空白對照組)、B組(AMD3100+生理鹽水組)、C組(AMD3100+G-CSF組)3組,每組各20只,AMD3100采取單日注射,G-CSF連續(xù)注射時間為5天,A組、B組、C組各設(shè)3d、5d、7d、10d四個時間點取材,到達(dá)各時間點后隨機取5只小鼠,腹腔注射麻醉后心臟采血并進行流式細(xì)胞儀檢測CDllb、α-SMA陽性細(xì)胞標(biāo)記率,結(jié)果取均值以x+s表示,統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)并進行對比分析。[結(jié)果]A組在四個時間點雙免疫熒光染色陽性細(xì)胞比例均無明顯差異(p0.05)。B組與C組動員后雙免疫熒光染色陽性細(xì)胞比例呈升高趨勢,至第5天達(dá)到峰值,后又呈逐漸下降趨勢,且B組、C組各時間點雙陽性細(xì)胞比例均較A組增加(p0.05)；C組較B組雙陽性細(xì)胞比例增加(p0.05)；[結(jié)論]AMD3100聯(lián)合G-CSF和單一使用AMD3100對外周血cFb均有動員作用,且于動員后第5天cFb數(shù)量達(dá)到高峰；聯(lián)合動員效果優(yōu)于單一動員效果。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病 循環(huán)纖維細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞活性 糖尿病 聯(lián)合動員 循環(huán)纖維細(xì)胞 (cFb) AMD3100 G-CSF
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R641
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 第一部分 正常小鼠和糖尿病小鼠循環(huán)纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的比較15-30
• 引言15-16
• 材料與方法16-20
• 實驗結(jié)果20-24
• 討論24-27
• 參考文獻(xiàn)27-30
• 第二部分 AMD3100聯(lián)合G-CSF動員糖尿病小鼠循環(huán)纖維細(xì)胞的研究30-50
• 引言30-32
• 材料與方法32-37
• 實驗結(jié)果37-43
• 討論43-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 結(jié)論50
• 存在不足及改進方法50-51
• 綜述51-58
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果58-59
• 致謝59

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本文編號：901676