發(fā)布時(shí)間：2017-09-18 13:34

  本文關(guān)鍵詞：MiR-106b在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨關(guān)節(jié)破壞中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種累及關(guān)節(jié)的慢性炎癥性自身免疫性疾病,主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞。RA的發(fā)生機(jī)制尚不明確,目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的異常在RA的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。Mi R-106b是新近發(fā)現(xiàn)的一種mi RNA,既往研究證實(shí)其在肺癌、胃癌、肝癌和腎癌等組織中高表達(dá),主要作為一種癌基因發(fā)揮作用;近年來(lái)mi R-106b在炎癥、骨改建以及免疫調(diào)節(jié)中的作用也逐漸引起重視。本研究在成功制備牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型基礎(chǔ)上,研究調(diào)控mi R-106b對(duì)小鼠CIA的治療作用,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。目的:探討靶向干預(yù)mi R-106b對(duì)RA骨關(guān)節(jié)破壞的治療作用,并進(jìn)一步明確mi R-106b調(diào)控RA發(fā)生的機(jī)理。方法:雄性DBA/1小鼠40只,采用隨機(jī)數(shù)字表法分成4組:對(duì)照組(Sham組),慢病毒載體組(NC組),mi R-106b mimic組(Mimic組)和mi R-106b inhibitor組(Inhibitor組),每組10只小鼠。NC組,Mimic組和Inhibitor組在第二次免疫前1天(D20)分別經(jīng)眼眶注射空慢病毒載體、mi R-106b mimic和mi R-106b inhibitor,劑量為200μl(1×108U/ml);Sham組注射200μl生理鹽水。觀察小鼠的體重、足掌厚度,并對(duì)關(guān)節(jié)炎的腫脹程度進(jìn)行評(píng)分(每三天1次)。D56處死小鼠,Micro-CT檢查評(píng)估骨組織破壞程度,HE染色評(píng)估滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度,番紅O染色檢測(cè)軟骨破壞程度,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測(cè)成熟破骨細(xì)胞,免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)以及核因子-κB受體活化因子配體(receptor activators of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)和骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)的表達(dá)變化;RT-PCR檢測(cè)CIA小鼠膝關(guān)節(jié)中mi R-106b的表達(dá)變化;ELISA法檢測(cè)外周血中抗Ⅱ型膠原(collagenⅡ,CⅡ)抗體,TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、RANKL和OPG水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及T細(xì)胞亞群變化。結(jié)果:NC和Mimic組小鼠D21開始,體重明顯下降,與Sham組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Inhibitor組在D35時(shí)升高小鼠體重,在D42時(shí),小鼠體重明顯恢復(fù),與NC組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。D21開始CIA小鼠足爪出現(xiàn)較明顯的紅腫并逐漸加重,Inhibitor組小鼠足爪紅腫逐漸減輕,D49足掌厚度為(2.58±0.09)mm、關(guān)節(jié)炎評(píng)分為(10.2±0.98)與NC組[(3.06±0.07)mm,(13.8±1.65)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。Micro-CT掃描結(jié)果顯示NC和Mimic組有明顯的骨質(zhì)破壞,抑制mi R-106b后骨質(zhì)破壞明顯減輕;Inhibitor組骨體積(BV)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨面積分?jǐn)?shù)(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)分別為6.85±0.24 mm3、22.52±0.62%、9.46±2.02mm-1、0.31±0.06 mm,與NC組(5.61±0.35 mm3、16.26±1.42%、13.32±1.85 mm-1、0.24±0.06 mm)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。HE染色結(jié)果顯示CIA小鼠關(guān)節(jié)腔可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),滑膜增生明顯;靶向阻斷mi R-106b后滑膜組織炎癥明顯減輕。番紅O染色結(jié)果提示NC組和Mimic組軟骨細(xì)胞大量壞死,局部軟骨層幾乎完全消失,Inhibitor組軟骨細(xì)胞增多,軟骨層結(jié)構(gòu)較完整,軟骨破壞評(píng)分(0.92±0.37)明顯優(yōu)于NC組(2.5±0.51),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。TRAP染色結(jié)果顯示CIA小鼠關(guān)節(jié)破壞局部有大片紫紅色深染區(qū)域,Inhibitor組僅可見少量陽(yáng)性染色區(qū)域,提示mi R-106b inhibitor能夠抑制破骨細(xì)胞活化。定量RT-PCR結(jié)果顯示mi R-106b在CIA小鼠膝關(guān)節(jié)中高表達(dá),mi R-106b inhibitor能明顯降低mi R-106b在小鼠膝關(guān)節(jié)中的表達(dá),與NC組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示抑制mi R-106b能減少TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和RANKL的表達(dá),增加OPG的表達(dá)。血清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示,與Sham組比較,CIA小鼠血清中抗CⅡ抗體水平明顯升高,mi R-106b inhibitor治療后,抗CⅡ抗體含量降為(89.51±19.32ng/L),與NC組(118.53±11.32 ng/L)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。CIA小鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2的含量明顯增加,mi R-106b inhibitor能抑制上述因子的表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示,mi R-106b inhibitor能促進(jìn)OPG的分泌,抑制RANKL的表達(dá),使RANKL/OPG比值明顯降低,與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CIA小鼠脾臟中CD11b~+巨噬細(xì)胞、CD11c~+樹突狀細(xì)胞和GR1~+中性粒細(xì)胞比例顯著增高;同時(shí)CD4~+、CD28~+、CD154~+T細(xì)胞比例也明顯增高,而CD8~+T細(xì)胞比例減少,CD4~+/CD8~+比值上升。mi R-106b inhibitor治療組能顯著降低脾臟中CD11b~+、CD11c~+、CD11c~+以及CD4~+、CD28~+、CD154~+T細(xì)胞比例,同時(shí)升高CD8~+T細(xì)胞比例,恢復(fù)CD4~+/CD8~+比值。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)研究顯示抑制mi R-106b的表達(dá)可以減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥和骨質(zhì)破壞;抑制mi R-106b能減少CIA小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的分布;抑制mi R-106b能調(diào)節(jié)CIA小鼠脾臟中T細(xì)胞亞群的分布,恢復(fù)CD4~+/CD8~+比值。
【關(guān)鍵詞】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 炎癥 骨質(zhì)破壞 mi R-106b T淋巴細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R593.22
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-15
• 材料和方法15-31
• 結(jié)果31-44
• 討論44-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 綜述56-79
• 參考文獻(xiàn)68-79
• 中英文縮略詞表79-80
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文80-81
• 本研究得到以下基金資助81-82
• 致謝82-83

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本文編號(hào)：875841