本文關(guān)鍵詞：miR-375通過(guò)靶向PDK1抑制胎豬胰腺干細(xì)胞的增殖和分化

  更多相關(guān)文章： 胰腺干細(xì)胞(PSCs) miR-375 PDK1 增殖 凋亡 分化

【摘要】：胰腺干細(xì)胞(pancreatic stem cells,PSCs)是從胰腺中分離得到的,具有自我更新和多種分化能力的干細(xì)胞。在體內(nèi)外特定條件下能夠分化成為胰腺中的多種細(xì)胞,包括腺泡細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞和胰腺導(dǎo)管細(xì)胞,其自我更新和分化受到復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,近年來(lái)有報(bào)道表明miRNA(microRNA)在胰腺發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能,對(duì)胰腺的形成以及胰腺內(nèi)外分泌部功能的發(fā)揮都起到重要的調(diào)控作用。其中miR-375在胰腺發(fā)育到限定性內(nèi)胚層階段之前表達(dá)量激增并達(dá)到峰值,此后表達(dá)量降低到β細(xì)胞中miR-375低表達(dá)。因此,我們認(rèn)為在多種胰腺細(xì)胞中miR-375發(fā)揮不同甚至完全相反的功能。本研究我們以miR-375為主線,利用本實(shí)驗(yàn)室已分離并建系的胎豬PSCs,經(jīng)形態(tài)學(xué)、mRNA及蛋白多層面,采用包括qRT-PCR、流式細(xì)胞周期、流式細(xì)胞凋亡、Western Blotting、免疫熒光染色等多種檢測(cè)手段探究了miR-375在PSCs中發(fā)揮的作用及機(jī)制。通過(guò)生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)并利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證了miR-375在PSCs中發(fā)揮功能的一個(gè)重要下游靶基因——PDK1。研究發(fā)現(xiàn),miR-375能夠直接靶向PDK1抑制PSCs的增殖、存活和向β樣細(xì)胞的分化成熟,具體結(jié)論包括以下兩點(diǎn):1.miR-375對(duì)PSCs的增殖、存活和分化發(fā)揮抑制作用合成并轉(zhuǎn)染miR-375的模擬物(miR-375m)、抑制物(miR-375i)和無(wú)義物(N.C)過(guò)表達(dá)和抑制PSCs中的mi R-375。通過(guò)BrdU、MTT等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-375抑制PSCs增殖。通過(guò)qRT-PCR、Western Blotting和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mi R-375能夠抑制增殖相關(guān)基因的表達(dá)并誘導(dǎo)PSCs凋亡。后續(xù)我們又采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的PSCs向胰島樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化方案,并在誘導(dǎo)過(guò)程中轉(zhuǎn)染miR-375m和N.C,對(duì)誘導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析,并對(duì)誘導(dǎo)2周后的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過(guò)雙硫腙染色、qRT-PCR、免疫熒光染色和放射免疫法胰島素分析,我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-375能抑制PSCs向胰島素分泌細(xì)胞的分化。2.miR-375通過(guò)直接靶向PDK1發(fā)揮功能通過(guò)生物信息學(xué)手段,我們預(yù)測(cè)了miR-375的下游靶基因,結(jié)合關(guān)于胰腺發(fā)育信號(hào)調(diào)控的相關(guān)報(bào)道,我們把研究目標(biāo)鎖定于PDK1。經(jīng)qRT-PCR和Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),mi R-375能夠在蛋白水平下調(diào)PDK1,但不能改變其mRNA表達(dá)量。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-375能夠與PDK1靶向結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。通過(guò)Ki67和PDK1的免疫熒光共染實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-375能夠?qū)е翶i67和PDK1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的減少。此后我們檢測(cè)了PDK1的一個(gè)下游原件AKT的磷酸化水平,過(guò)表達(dá)miR-375能導(dǎo)致AKT磷酸化水平下調(diào),檢測(cè)結(jié)果表明,miR-375靶向PDK1,并通過(guò)PDK1-AKT通路調(diào)控PSCs。3.PDK1能夠促進(jìn)PSCs增殖和分化用PDK1抑制劑OSU-03012處理細(xì)胞,抑制PDK1的功能通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),OSU-03012會(huì)引起PSCs周期阻滯和凋亡的增加。qRT-PCR、免疫熒光染色、Western Blotting檢測(cè)增殖和凋亡相關(guān)基因發(fā)現(xiàn),OSU-03012會(huì)引起細(xì)胞增殖基因和抗凋亡基因的下調(diào),同時(shí)上調(diào)凋亡基因的表達(dá)。同時(shí)我們還在誘導(dǎo)分化體系中添加了OSU-03012,發(fā)現(xiàn)分化后的胰島素樣細(xì)胞團(tuán)數(shù)減少、體積縮小、結(jié)構(gòu)松散。誘導(dǎo)2w后收集細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),胰島細(xì)胞團(tuán)分化成熟相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明,OSU-03012會(huì)抑制PSCs的增殖及分化,因此我們推斷PDK1能促進(jìn)PSCs的增殖和分化。
【關(guān)鍵詞】：胰腺干細(xì)胞(PSCs) miR-375 PDK1 增殖 凋亡 分化
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1;Q25
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 文獻(xiàn)綜述12-29
• 第一章 干細(xì)胞治療糖尿病研究進(jìn)展12-29
• 1.1 糖尿病12-16
• 1.1.1 對(duì)糖尿病問(wèn)題的認(rèn)識(shí)12-13
• 1.1.2 全球糖尿病流行趨勢(shì)13-16
• 1.1.3 糖尿病及其并發(fā)癥治療開(kāi)支16
• 1.2 干細(xì)胞治療糖尿病研究進(jìn)展16-22
• 1.2.1 ESCs18
• 1.2.2 iPSCs18-19
• 1.2.3 MSCs19-21
• 1.2.4 PSCs21-22
• 1.3 miR-375研究進(jìn)展22-29
• 1.3.1 microRNA與胰腺信號(hào)調(diào)控22-25
• 1.3.2 miR-375在胰腺信號(hào)調(diào)控中的作用25-29
• 實(shí)驗(yàn)研究29-61
• 第二章 miR-375調(diào)控PSCs的自我更新和分化29-48
• 2.1 材料29-30
• 2.2 方法30-38
• 2.3 結(jié)果38-47
• 2.3.1 miR-375抑制PSCs的增殖38-42
• 2.3.2 miR-375誘導(dǎo)PSCs凋亡42-44
• 2.3.3 miR-375抑制PSCs向胰島素分泌細(xì)胞的分化44-47
• 2.4 討論47
• 2.5 小結(jié)47-48
• 第三章 miR-375通過(guò)靶向PDK1調(diào)控PSCs功能48-61
• 3.1 材料48-49
• 3.2 方法49-50
• 3.3 結(jié)果50-59
• 3.3.1 miR-375下游靶基因篩選50-51
• 3.3.2 miR-375直接靶向PDK1調(diào)控PSCs51-55
• 3.3.3 PDK1調(diào)控PSCs增殖、凋亡和分化55-59
• 3.4 討論59-60
• 3.5 小結(jié)60-61
• 全文總結(jié)61-62
• 本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)與進(jìn)一步的研究課題62-63
• 參考文獻(xiàn)63-76
• 附錄76-79
• 縮略詞79-80
• 致謝80-82
• 作者簡(jiǎn)介82

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