本文關(guān)鍵詞：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞差異表達(dá)lncRNAs檢測及初步生物信息學(xué)分析

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【摘要】：目的:長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)作為介導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控的功能性RNA分子,參與機(jī)體多種生理和病理過程。然而,有關(guān)lncRNA分子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)中的功能和作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本文通過分析研究RA患者和外傷患者關(guān)節(jié)FLSs中差異表達(dá)的lncRNAs,初步探索lncRNAs在RA發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:取手術(shù)切取的3例RA患者和3例外傷患者的膝關(guān)節(jié)滑膜組織,原代培養(yǎng)滑膜FLSs至第3代。用Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0對FLSs中的lncRNAs和mRNAs進(jìn)行檢測,篩選出差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs(差異倍數(shù)2,P0.05)。對轉(zhuǎn)錄差異表達(dá)mRNAs的基因進(jìn)行基因本體和信號通路分析。隨后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證可能與RA發(fā)病機(jī)制有關(guān)的差異表達(dá)mRNAs和lncRNAs。分析差異表達(dá)的lncRNAs與RA相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和疾病活動(dòng)性指數(shù)之間的關(guān)系。進(jìn)行受試者工作特征曲線(ROC)分析,評估差異表達(dá)的lncRNAs對RA的診斷價(jià)值。采用Cytoscape軟件構(gòu)建mRNA-lncRNA共表達(dá)分析網(wǎng)絡(luò),分析預(yù)測差異表達(dá)的lncRNAs功能和致病機(jī)制。結(jié)果:1.芯片結(jié)果顯示,與對照組(CON-FLSs)相比,RA-FLSs中共發(fā)現(xiàn)有135條lncRNAs差異表達(dá),其中62條上調(diào),73條下調(diào);103條mRNAs差異表達(dá),其中36條表達(dá)上調(diào),67條表達(dá)下調(diào)。2.定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,與CON-FLSs相比,RA-FLSs中ENST00000483588表達(dá)上調(diào),ENST00000438399、uc004afb.1和ENST00000452247表達(dá)下調(diào),和芯片結(jié)果一致。3.ENST00000483588、ENST00000438399、uc004afb.1和ENST00000452247的ROC曲線下面積分別為0.85,0.92,0.97和0.92,提示這些差異表達(dá)的lncRNAs可能對RA有一定的診斷價(jià)值。此外,在RA患者中,ENST00000483588的表達(dá)水平與C-反應(yīng)蛋白(CRP)水平和簡化的疾病活性指數(shù)(SDAI)得分呈正相關(guān)。4.lncRNA-mRNA共表達(dá)分析結(jié)果顯示ENST00000483588、ENST00000438399、uc004afb.1和ENST00000452247分別和9、9、8和12個(gè)mRNAs有較一致的表達(dá)模式。5.基因本體分析結(jié)果顯示,上調(diào)的mRNAs參與了373個(gè)生物學(xué)過程,15個(gè)細(xì)胞組成成分,34個(gè)分子功能;下調(diào)的mRNAs參與了129個(gè)生物學(xué)過程,17個(gè)細(xì)胞組成成分,20個(gè)分子功能。信號通路分析結(jié)果顯示,上調(diào)的mRNAs參與了9條信號通路,下調(diào)的mRNA參與了27條信號通路。結(jié)論:1.與對照組相比,RA-FLSs中l(wèi)ncRNAs表達(dá)譜發(fā)生了顯著變化,其中ENST00000483588表達(dá)上調(diào),ENST00000438399、uc004afb.1和ENST00000452247表達(dá)下調(diào)。ENST00000483588表達(dá)水平與疾病活動(dòng)性指標(biāo)CRP水平及SDAI得分呈正相關(guān)關(guān)系,可能對診斷和評估RA疾病活動(dòng)性有潛在的價(jià)值。2.生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,RA-FLSs中差異表達(dá)的編碼基因參與了雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)、細(xì)胞凋亡等信號通路,涉及了細(xì)胞生長遷移、白細(xì)胞激活分化、血管通透性改變等生物學(xué)過程;RA-FLSs差異表達(dá)的lncRNAs可能參與了RA-FLSs增殖、凋亡平衡失調(diào)及骨形成修復(fù)異常等過程。
【關(guān)鍵詞】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 成纖維樣滑膜細(xì)胞 長鏈非編碼RNA 芯片
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 主要英文縮略詞索引13-14
• 第一章 緒論14-24
• 1.1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎概論14-17
• 1.1.1 RA的發(fā)病機(jī)制14-16
• 1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展16
• 1.1.3 RA緩解指標(biāo)進(jìn)展16-17
• 1.2 長鏈非編碼RNA概論17-20
• 1.3 lncRNA與免疫細(xì)胞及風(fēng)濕性疾病的關(guān)系20-24
• 1.3.1 lncRNA在免疫細(xì)胞中的作用21-22
• 1.3.2 lncRNA在風(fēng)濕性疾病中的作用22-24
• 第二章 FLSs原代培養(yǎng)及鑒定24-32
• 2.1 研究目的24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料24-26
• 2.2.1 研究對象和標(biāo)本收集24
• 2.2.2 主要試劑和耗材24-25
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑配制25
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器25-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法26-28
• 2.3.1 FLSs原代培養(yǎng)26-28
• 2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定FLSs純度28
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-30
• 2.4.1 原代培養(yǎng)細(xì)胞28-29
• 2.4.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定FLSs細(xì)胞純度29-30
• 2.5 討論30-32
• 第三章 RA患者FLSs長鏈非編碼RNA檢測分析32-48
• 3.1 研究目的32
• 3.2 材料32-34
• 3.2.1 研究對象32
• 3.2.2 主要試劑和耗材32-33
• 3.2.3 試劑配制33
• 3.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器33-34
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法34-39
• 3.3.1 RNA提取34
• 3.3.2 總RNA純化34-35
• 3.3.3 RNA質(zhì)量檢測35
• 3.3.4 逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記反應(yīng)35-36
• 3.3.5 RNA純化及cRNA質(zhì)量檢測36-37
• 3.3.6 雜交37-38
• 3.3.7 芯片洗滌38
• 3.3.8 數(shù)據(jù)提取38-39
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-46
• 3.4.1 總RNA提取結(jié)果39-40
• 3.4.2 芯片結(jié)果火山圖分析40-41
• 3.4.3 差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs41-46
• 3.4.4 聚類分析46
• 3.5 討論46-48
• 第四章 差異表達(dá)lncRNA的驗(yàn)證及其與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析48-64
• 4.1 研究目的48
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料48-50
• 4.2.1 研究對象48-49
• 4.2.2 主要試劑和耗材49
• 4.2.3 試劑配制49
• 4.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器49-50
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法50-52
• 4.3.1 RNA提取50
• 4.3.2 總RNA純化50
• 4.3.3 RNA質(zhì)量檢測50
• 4.3.4 lncRNA分類50
• 4.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR50-51
• 4.3.6 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及疾病活動(dòng)性指標(biāo)51-52
• 4.3.7 lncRNA-mRNA共表達(dá)分析52
• 4.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析52
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-61
• 4.4.1 lncRNAs分類52-53
• 4.4.2 定量PCR結(jié)果53-55
• 4.4.3 相關(guān)性分析55-56
• 4.4.4 ROC曲線分析56
• 4.4.5 lncRNA-mRNA共表達(dá)分析56-61
• 4.5 討論61-64
• 第五章 差異表達(dá)基因的初步生物信息學(xué)分析及驗(yàn)證64-75
• 5.1 研究目的64
• 5.2 材料64-65
• 5.2.1 研究對象64
• 5.2.2 主要試劑和耗材64
• 5.2.3 試劑配制64
• 5.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器64-65
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法65-67
• 5.3.1 RNA提取65
• 5.3.2 總RNA純化65
• 5.3.3 RNA質(zhì)量檢測65
• 5.3.4 信號通路分析65
• 5.3.5 基因本體分析65
• 5.3.6 實(shí)時(shí)定量PCR65-66
• 5.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析66-67
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-73
• 5.4.1 RA-FLSs mRNA表達(dá)譜67
• 5.4.2 信號通路（pathway）分析67-68
• 5.4.3 基因本體（GO）分析68-72
• 5.4.4 細(xì)胞定量PCR結(jié)果72-73
• 5.5 討論73-75
• 第六章 主要結(jié)論75-76
• 參考文獻(xiàn)76-80
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章80-81
• 致謝81

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本文編號：846767