本文關(guān)鍵詞：microRNA-195在肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景葡萄糖攝取是機(jī)體內(nèi)新陳代謝中極其重要的一個(gè)生物進(jìn)程且調(diào)控著人類機(jī)體內(nèi)的多個(gè)信號通路及蛋白表達(dá),葡萄糖攝取障礙會導(dǎo)致胰島素抵抗以及其他代謝的異常,進(jìn)而誘發(fā)糖尿病以及癌癥等威脅人類健康的各種疾病。棕櫚酸(PA)做為飽和脂肪酸的一種已經(jīng)被證明了可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞形成葡萄糖攝取障礙,建立胰島素抵抗模型。微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)是一類非編碼的小分子單鏈RNA,通過與其目標(biāo)m RNA分子的3'端(3'UTR)互補(bǔ)匹配導(dǎo)致該m RNA分子的翻譯受到抑制,而后在分子水平上調(diào)控各種信號通路。有大量研究結(jié)果顯示mi RNAs可以調(diào)控葡萄糖動態(tài)平衡。mi R-195也已經(jīng)被證明,可以調(diào)控多種信號通路及蛋白的表達(dá)且與糖尿病的發(fā)生及發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián),但其對葡萄糖攝取進(jìn)程的影響及具體分子機(jī)制尚不明確。研究目的1.明確mi R-195在棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取障礙中是否表達(dá)異常;2.驗(yàn)證mi R-195是否調(diào)控肝細(xì)胞L02的葡萄糖攝取障礙進(jìn)程;3.mi R-195靶基因的篩選及驗(yàn)證;4.探究mi R-195在肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取障礙中的具體機(jī)制。第一部分PA處理肝細(xì)胞L02后micro RNA-195表達(dá)變化情況以不同濃度棕櫚酸PA(0.6 mmol/L,1 mmol/L)分別誘導(dǎo)肝細(xì)胞L02 8h,于倒置顯微鏡下觀察處理后的肝細(xì)胞L02的形態(tài),然后運(yùn)用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測各個(gè)組中肝細(xì)胞L02的葡萄糖攝取能力,RT-PCR技術(shù)檢測mi R-195的表達(dá)變化情況。研究方法1.倒置顯微鏡下觀察棕櫚酸處理肝細(xì)胞L02后的形態(tài)變化;2.葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測不同濃度棕櫚酸處理肝細(xì)胞L02后葡萄糖攝取能力;3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測葡萄糖攝取障礙后mi R-195表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.顯微鏡下初步觀察到棕櫚酸(PA)處理的肝細(xì)胞L02的細(xì)胞形態(tài)明顯模糊化,邊緣不清晰無明顯棱角且呈橢圓狀,細(xì)胞與細(xì)胞間隔松散無清晰界限,細(xì)胞核增大;2.葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測結(jié)果證實(shí)(0.6 mmol/L和1 mmol/L)濃度的PA處理肝細(xì)胞L02后細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的葡萄糖濃度比對照組高,說明肝細(xì)胞L02在一定濃度棕櫚酸的誘導(dǎo)下葡萄糖攝取能力降低,且隨著PA濃度的提高,其葡萄糖攝取能力有越來越低的趨勢;3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取障礙后mi R-195表達(dá)升高。結(jié)論0.6 mmol/L,1 mmol/L的PA誘導(dǎo)肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取障礙,且肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取障礙后mi R-195高表達(dá)。第二部分micro RNA-195對肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取的影響葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測高表達(dá)及低表達(dá)mi R-195后其葡萄糖攝取能力的變化以及棕櫚酸處理高表達(dá)及低表達(dá)mi R-195后的肝細(xì)胞L02的葡萄糖攝取能力的變化。Western-blot法驗(yàn)證GLUT1和GLUT4在高表達(dá)及低表達(dá)mi R-195后的表達(dá)變化。研究方法1.激光共聚焦檢測肝細(xì)胞L02轉(zhuǎn)染mi R-195 mimic以及mi R-195 inhibitor后的熒光強(qiáng)度,計(jì)算轉(zhuǎn)染效率;2.實(shí)時(shí)定量PCR檢測肝細(xì)胞L02轉(zhuǎn)染mi R-195 mimic以及mi R-195 inhibitor后的mi R-195的表達(dá);3.葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測mi R-195高表達(dá)及低表達(dá)后肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取能力的變化;葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測棕櫚酸處理mi R-195高表達(dá)及低表達(dá)后的肝細(xì)胞L02的葡萄糖攝取能力的變化;4.Western-blot法檢測mi R-195高表達(dá)或低表達(dá)后GLUT1和GLUT4的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.激光共聚焦檢測肝細(xì)胞L02轉(zhuǎn)染mi R-195 mimic以及mi R-195 inhibitor后的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到40%;2.實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果證實(shí)了肝細(xì)胞L02轉(zhuǎn)染mi R-195 mimic后mi R-195的表達(dá)升高,轉(zhuǎn)染mi R-195 inhibitor后mi R-195的表達(dá)降低;3.葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法結(jié)果證實(shí)了過表達(dá)mi R-195后肝細(xì)胞L02葡萄糖的攝取能力較Control降低,低表達(dá)mi R-195后肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取能力較Control組有所提高。葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法的結(jié)果證實(shí)了PA誘導(dǎo)與mi R-195高表達(dá)同時(shí)干預(yù)有增強(qiáng)葡萄糖攝取障礙的趨勢;4.Western-blot的結(jié)果證明了高表達(dá)mi R-195下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1的表達(dá)。結(jié)論過表達(dá)mi R-195后肝細(xì)胞L02的葡萄糖攝取能力較對照組降低,而低表達(dá)mi R-195后肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取能力較對照組有所提高;櫚酸處理與mi R-195高表達(dá)同時(shí)作用于肝細(xì)胞L02可加強(qiáng)其葡萄糖攝取障礙;過表達(dá)mi R-195可下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1的表達(dá)。第三部分micro RNA-195靶基因Sirt-1的預(yù)測及驗(yàn)證基于多種數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測mi R-195的靶基因以及Western-blot法驗(yàn)證其是否為miR-195的靶基因,并探究其靶基因與葡萄糖代謝相關(guān)蛋白之間的作用機(jī)制。研究方法1.基于多種數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測mi R-195的靶基因;2.Western-blot檢測mi R-195高表達(dá)及低表達(dá)后候選靶基因Sirt-1的表達(dá)變化;3.Western-blot檢測Sirt-1表達(dá)被干涉后GLUT1和GLUT4的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.多種數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測mi R-195的靶基因可能性較大的為Sirt-1;2.Western-blot檢測mi R-195高表達(dá)后Sirt-1表達(dá)降低,低表達(dá)后Sirt-1表達(dá)升高;3.Western-blot檢測Sirt-1表達(dá)被干涉后GLUT1和GLUT4表達(dá)均降低。結(jié)論mi R-195的靶基因很有可能是Sirt-1,并且mi R-195通過下調(diào)Sirt-1來降低GLUT1和GLUT4的表達(dá),進(jìn)而來調(diào)控肝細(xì)胞L02的葡萄糖攝取。
【關(guān)鍵詞】：miR-195 葡萄糖攝取 Sirt-1 GLUT1 肝細(xì)胞L02
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-25
• 第一部分 棕櫚酸處理肝細(xì)胞L02后microRNA-195表達(dá)變化情況25-35
• 1 材料25-28
• 2 方法28-30
• 3 結(jié)果30-32
• 4 討論32-35
• 第二部分 microRNA-195對肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取的影響35-46
• 1 材料35-37
• 2 方法37-40
• 3 結(jié)果40-43
• 4 討論43-46
• 第三部分 micro RNA-195靶基因Sirt-1 的預(yù)測及驗(yàn)證46-53
• 1 材料46-47
• 2 方法47-49
• 3 結(jié)果49-50
• 4 討論50-53
• 小結(jié)53-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 個(gè)人簡歷和研究成果63-64
• 致謝64

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本文編號：825612