本文關(guān)鍵詞：血小板Aβ-protein淀粉樣變成分的研究

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【摘要】：目的:淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假設(shè)學(xué)說認(rèn)為淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過特定酶的剪切最終形成的β淀粉樣蛋白(Amyloid beta,Aβ)會(huì)促進(jìn)阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)的形成和發(fā)展。阿爾茨海默病患者的腦組織皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞外形成的老年斑塊和纖維纏結(jié)中主要成分就是β淀粉樣蛋白形成的不可溶性的淀粉樣纖維。此外在AD患者的腦實(shí)質(zhì)微血管壁上也存在大量Aβ聚集形成的纖維性斑塊,導(dǎo)致血管出現(xiàn)病理性損害,局部血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變,伴隨動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、高血脂等,最終使腦血流量減少,海馬區(qū)神經(jīng)元發(fā)生退行性變性,突觸死亡,腦部神經(jīng)元傳導(dǎo)通路故障,最終導(dǎo)致癡呆。目前已知在外周循環(huán)中,血小板是β淀粉樣蛋白的主要載體,約占外周循環(huán)中Aβ淀粉樣蛋白總量的95%以上,在外周循環(huán)中血小板激活后會(huì)粘附到受損的血管壁上,并且在血小板的α顆粒中形成的Aβ淀粉樣多肽會(huì)隨著血小板的激活釋放出來,本文通過比較健康對(duì)照人群和老年癡呆患者血小板中β多肽的表達(dá)形式以及血小板的激活狀態(tài),探究血小板在AD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)淀粉樣變纖維斑塊形成以及AD發(fā)病機(jī)制中的作用,為AD淀粉樣變形成分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。方法:1.遵照嚴(yán)格的臨床對(duì)于阿爾茨海默病的篩查和診斷標(biāo)準(zhǔn),篩選天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2013年9月至2015年10月阿爾茨海默病患者30例,作為實(shí)驗(yàn)組(AD組);此外按照與AD患者年齡、性別相匹配的標(biāo)準(zhǔn),從天津九華體檢中篩選健康體檢人群90例,作為健康對(duì)照組(HC組)。抽取4ml靜脈全血,EDTA-2Na抗凝用于實(shí)驗(yàn)研究;此外還有病變的心肌、腎組織來自臨床獲得的阿爾茨海默病患者。2.將心肌組織制成石蠟切片,分別用剛果紅染色(Congo Red,CR)、硫磺素T(Thioflavin-T,ThT)熒光染色、蘇丹黑染色以及轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)抗體的免疫組織化學(xué)染色對(duì)阿爾茨海默病患者的病變心肌組織進(jìn)行淀粉樣變的檢測,通過CR與ThT染色對(duì)淀粉樣變的特異性比較,尋找淀粉樣變特異的檢測探針。3.提取病變心肌組織的淀粉樣變纖維聚集物,用QCM親和試驗(yàn)測定淀粉樣變纖維聚集物與ThT之間的親和性和結(jié)合特異性,結(jié)果證實(shí)心肌組織中的淀粉樣變纖維聚集物和以和ThT發(fā)生特異性結(jié)合;通過用Aβ的單克隆抗體WB實(shí)驗(yàn),證實(shí)ThT特異性結(jié)合的心肌組織中的淀粉樣纖維聚集物為Aβ淀粉。從而證實(shí)ThT可以檢測Aβ樣纖維聚集物,并且檢測具有很高的特異性。4.抽取AD組和HC組受試者的靜脈全血4ml,留取100μl,用于全血的ThT熒光探針染色。其余血液通過密度梯度離心法提取血小板并洗滌之后,用于血小板的ThT染色和血小板蛋膜白的分離提取。5.分別將全血和洗滌后的血小板進(jìn)行ThT染色,探討用ThT對(duì)血小板β淀粉樣纖維/聚集物染色的特異性實(shí)驗(yàn)中,血漿的存在是否對(duì)ThT識(shí)別血小板Aβ纖維/聚集物的特異性存在影響。6.通過ThT熒光強(qiáng)度定量實(shí)驗(yàn),比較AD患者組和HC組血小板上淀粉樣變之間的差異,包括觀察淀粉樣變水平AD組和HC組不同年齡組之間的關(guān)系。7.采用WB技術(shù)證實(shí)血漿中和血小板中存在Aβ淀粉樣纖維/聚集物和對(duì)組織切片的免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)血小板在形成初期時(shí)就已經(jīng)有β淀粉樣成分以及淀粉樣纖維/聚集物。8.檢測AD組和HC組ThT特異性實(shí)驗(yàn)中陽性血小板個(gè)體數(shù)占總血小板的百分比,及個(gè)體ThT陽性血小板數(shù)占總體血小板數(shù)量百分比。9.通過對(duì)血小板各項(xiàng)物理指數(shù)的測定和比較分析,探討在AD組和HC組之間的血液狀態(tài)和血小板活性的改變。結(jié)果:1.剛果紅(CR)染色結(jié)合偏振光檢測結(jié)果顯示剛果紅能夠特異性識(shí)別心肌組織的淀粉樣變纖維結(jié)構(gòu),并且將組織切片經(jīng)過ThT對(duì)染色發(fā)現(xiàn)淀粉樣變陽性部位與CR染色顯示的淀粉樣變沉積部位重疊,非淀粉樣變沉積部位ThT熒光染色陰性,ThT對(duì)組織淀粉樣變纖維的染色敏感度高于CR染色,以上結(jié)果說明ThT對(duì)與組織淀粉樣變纖維具有高度親和性,可以用來特異性顯示淀粉樣變纖維結(jié)構(gòu)。2.淀粉樣變?nèi)旧Y(jié)合抗Aβ抗體細(xì)胞免疫染色,探索血小板Aβ纖維/聚集物ThT特異性染色條件,染色結(jié)果不受血漿成分干擾,染色方法簡易可行。3.ThT探針與血小板膜上Aβ纖維/聚集物具有親和反應(yīng),可清楚觀察血小板上淀粉樣變;并且能夠特異識(shí)別血小板膜上的β-淀粉樣變纖維/聚集物結(jié)合,提示血小板上存在淀粉樣變纖維/聚集物。4.血小板在AD組和HC組中,ThT染色試驗(yàn)均為百分百陽性,并且針對(duì)個(gè)體而言,在其不同年齡階段的血小板也均呈陽性結(jié)果。5.采用WB技術(shù)對(duì)血小板膜蛋白的分析證實(shí)血漿中和血小板中存在Aβ淀粉樣纖維/聚集物,并且在AD組和HC組中,Aβ淀粉樣纖維/聚集物的表達(dá)形式不同,AD組中Aβ的表達(dá)形式為70k D和15k D,而HC組中Aβ淀粉樣纖維/聚集物的表達(dá)形式為43k D和26k D。6.通過對(duì)AD組和HC組的血小板物理指數(shù)的比較發(fā)現(xiàn)D-二聚體(D-Dim)和血小板比積(PCT)在兩組之間有顯著差異,AD組大于HC組,說明AD中,患者血液處于高凝狀態(tài),血小板處于預(yù)激活狀態(tài)相符合。結(jié)論:1.通過ThT染色能夠特異識(shí)別β-淀粉樣變纖維,探索一種特異性檢測血細(xì)胞淀粉樣變的方法,并且實(shí)現(xiàn)檢測血小板的淀粉樣變纖維,該方法可用于檢測血細(xì)胞淀粉樣變。2.首次報(bào)道人血小板中存在Aβ淀粉樣變纖維,利用淀粉樣變熒光探針(ThT)結(jié)合WB,測定血小板淀粉樣變纖維水平,發(fā)現(xiàn)且AD患者血小板中淀粉樣變纖維聚集形式與健康對(duì)照組存在差異。3.分析淀粉樣變纖維陽性血小板形態(tài)學(xué)特征和兩組血小板物理指數(shù),發(fā)現(xiàn)血漿D-二聚體(D-Dim)和血小板比積(PCT)在兩組之間有顯著差異,AD患者血小板淀粉樣變纖維可導(dǎo)致血小板形態(tài)學(xué)異常。
【關(guān)鍵詞】：淀粉樣變 阿爾茨海默病 血小板 血小板物理參數(shù) 硫磺素T 剛果紅
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R597.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 縮略語/符號(hào)說明14-15
• 前言15-23
• 研究現(xiàn)狀、成果15-21
• 研究目的、方法21-23
• 一、研究組織淀粉樣變的提取和檢測方法23-42
• 1.1 對(duì)象和方法23-35
• 1.1.1 研究對(duì)象23
• 1.1.2 試劑23-24
• 1.1.3 儀器24
• 1.1.4 方法24-35
• 1.2 結(jié)果35-39
• 1.2.1 組織的剛果紅染色結(jié)果35-36
• 1.2.2 AD患者心肌組織的剛果紅、蘇丹黑、抗甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TTR）的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果36-37
• 1.2.3 AD患者心肌組織的剛果紅染色和硫磺素T復(fù)染結(jié)果37-38
• 1.2.4 QCM試驗(yàn)鑒定硫磺素T與Aβ 纖維的結(jié)合特異性結(jié)果38
• 1.2.5 WB對(duì)Aβ 纖維聚集物的鑒定結(jié)果38-39
• 1.3 討論39-41
• 1.3.1 剛果紅對(duì)淀粉樣變的鑒定39-40
• 1.3.2 剛果紅蘇丹黑復(fù)染、TTR抗體免疫組化對(duì)淀粉樣變成分的鑒定40
• 1.3.3 QCM結(jié)合試驗(yàn)中Aβ 纖維/聚集物與硫磺素T的結(jié)合親和力40
• 1.3.4 心肌組織剛果紅與硫磺素T復(fù)染40-41
• 1.4 小結(jié)41-42
• 二、探究Aβ 在血小板上的表達(dá)形式并且作為AD診斷標(biāo)志物的研究42-62
• 2.1 對(duì)象和方法42-54
• 2.1.1 研究對(duì)象42-43
• 2.1.2 試劑43
• 2.1.3 儀器43-44
• 2.1.4 方法44-54
• 2.2 結(jié)果54-58
• 2.2.1 血漿對(duì)ThT熒光染色的影響結(jié)果54
• 2.2.2 AD組與HC組血小板ThT染色陽性百分率及分布范圍54-56
• 2.2.3 WB鑒定血漿和血小板中Aβ 的存在形式56-57
• 2.2.4 AD組與HC組血小板物理學(xué)指數(shù)比較分析57-58
• 2.3 討論58-60
• 2.3.1 ThT能夠特異性識(shí)別血小板上存在的Aβ 纖維58
• 2.3.2 血小板Aβ 纖維ThT特異性染色結(jié)果不受血漿干擾58-59
• 2.3.3 血小板在AD組和HC組中ThT染色試驗(yàn)均為百分百陽性59
• 2.3.4 血小板中存在Aβ 纖維聚集物成分，，不同組之間Aβ 的存在形式有差異59-60
• 2.3.5 AD組與HC組血小板物理學(xué)指數(shù)比較分析60
• 2.4 小結(jié)60-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明71-72
• 綜述 血小板與阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的聯(lián)系72-84
• 綜述參考文獻(xiàn)79-84
• 致謝84-85
• 個(gè)人簡歷85

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6 蔡綏R

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