本文關(guān)鍵詞：基質(zhì)金屬蛋白酶在糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥中的作用研究

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【摘要】：背景：糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid, GC可發(fā)揮非特異性抗炎、抗毒、抗休克及其免疫抑制等藥理學(xué)效應(yīng),因而被廣泛用作炎癥、器官移植、自身免疫疾病及腫瘤治療等領(lǐng)域。但是作為其主要副作用之一的糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIO)的發(fā)病率卻逐年升高,成為了臨床上迫切需要解決的難題。作為最為常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥,GIO是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞、骨密度減低、骨的脆性增加并且骨折風(fēng)險(xiǎn)性升高為特征的代謝性骨病,GIO的發(fā)病機(jī)制及其防治也越來越受到關(guān)注。長期大劑量應(yīng)用GC后,成骨細(xì)胞的增殖受到抑制,成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡數(shù)量增加,最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞的骨形成能力下降；GC還可使破骨細(xì)胞的生成增多,增加破骨細(xì)胞的數(shù)目,同時(shí)增強(qiáng)其活性,促進(jìn)破骨細(xì)胞性骨吸收,進(jìn)而導(dǎo)致骨量丟失,造成骨質(zhì)疏松的發(fā)生�；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一類高度保守的蛋白水解酶,由鋅離子依賴性酶組成,可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì),從而參與組織再造和器官形成。MMPs通過參與骨改建過程,在骨組織的新陳代謝活動(dòng)中發(fā)揮著極其重要的作用,同時(shí)其基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成及表達(dá)均受到多種生長因子、細(xì)胞因子及激素等因素不同程度的調(diào)節(jié)。因此,對MMPs的研究可以為骨質(zhì)疏松的治療提供一定的理論依據(jù)及新的思路。目的：本課題通過檢測GIO小鼠骨組織中MMP-2、9、13表達(dá)水平的變化及其在體外給予GC后檢測骨樣細(xì)胞中MMP-2、13mRNA的表達(dá)變化,探討MMPs表達(dá)異常與GIO的關(guān)系,為GIO的預(yù)防和治療方案的選擇提供一定的理論依據(jù)。方法：第一階段：本實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)7周齡昆明小鼠(20只),隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。在適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)灌胃給予氫化潑尼松(15mg/kg),隔日給藥1次；對照組給予等量PBS。2周后行4%多聚甲醛經(jīng)心臟內(nèi)灌注固定處死小鼠,取脛骨進(jìn)行常規(guī)固定、脫鈣、石蠟包埋、切片,通過HE染色觀察組織學(xué)改變；進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和組織蛋白酶K(CK)的免疫組織化學(xué)染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)量、分布及活性；采用免疫組織化學(xué)方法檢測骨組織中SOST、DMP-1、 MMP-2、MMP-9、MMP-13的表達(dá)；并對上述結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。第二階段：我們通過體外培養(yǎng)小鼠MLO-Y4骨樣細(xì)胞系,并給予不同濃度(10-6M, 10-7M,10"8M)的地塞米松(Dex)進(jìn)行干預(yù)。采用MTT法檢測細(xì)胞增殖；采用實(shí)時(shí)定量熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測骨樣細(xì)胞中MMP-2、 MMP-13mRNA的表達(dá)。結(jié)果：第一階段：1.骨小梁：相比對照組,實(shí)驗(yàn)組小鼠①脛骨松質(zhì)骨區(qū)域骨量(BV/TV)明顯減少,生長板變薄,皮質(zhì)骨變窄；②脛骨松質(zhì)骨中TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色陽性破骨細(xì)胞明顯增多,且CK免疫組織化學(xué)染色提示破骨吸收較為活躍；③脛骨松質(zhì)骨區(qū)域內(nèi)MMP-2, MMP-9, MMP-13表達(dá)明顯增多。2.皮質(zhì)骨：相比對照組,實(shí)驗(yàn)組小鼠①脛骨皮質(zhì)骨中骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少；②脛骨皮質(zhì)骨中骨陷窩不同程度的擴(kuò)大,并且空陷窩的數(shù)量增加;③脛骨皮質(zhì)骨中出現(xiàn)大小不一的裂隙,在HE染色中呈現(xiàn)與周圍正常骨皮質(zhì)不均一的染色狀態(tài)；④脛骨皮質(zhì)骨中DMP-1表達(dá)有所減少,SOST表達(dá)增多；MMP-2表達(dá)明顯增加,且主要集中在骨細(xì)胞及骨陷窩內(nèi)表達(dá)；MMP-13表達(dá)有所增加,并且主要在裂隙中表達(dá)；MMP-9表達(dá)無明顯差異。第二階段：1.MTT法顯示,加入Dex后,MLO-Y4細(xì)胞增殖受到抑制,并與給藥濃度和時(shí)間相關(guān)。2. qRT-PCR結(jié)果表明,Dex增加了MLO-Y4骨樣細(xì)胞中MMP-2、-13mRNA的表達(dá)水平,并呈劑量、時(shí)間依賴效應(yīng)。結(jié)論：應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后,小鼠脛骨骨小梁中MMP-2、9、13的表達(dá)明顯增多提示松質(zhì)骨骨量減少與MMP-2、9、13增多相關(guān)。皮質(zhì)骨中骨細(xì)胞發(fā)生骨細(xì)胞性骨溶解,MMP-2、13表達(dá)增多并且多集中在骨細(xì)胞及皮質(zhì)骨裂隙中,提示MMP-2、13與皮質(zhì)骨早期損害及糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生具有密切的聯(lián)系。體外培養(yǎng)骨樣細(xì)胞并給予糖皮質(zhì)激素后,細(xì)胞的增殖受到抑制,MMP-2、13mRNA的表達(dá)增多。該研究從體內(nèi)和體外兩個(gè)方面論證了GC對骨細(xì)胞中MMPs的誘導(dǎo)作用,為糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥提供了新的治療思路和理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：基質(zhì)金屬蛋白酶 糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥 骨細(xì)胞 骨溶解
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R580
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 符號(hào)說明12-13
• 前言13-17
• 第一部分 糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松小鼠中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)17-43
• 1. 材料與方法17-22
• 2. 結(jié)果22-32
• 3. 討論32-37
• 4. 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-43
• 第二部分 糖皮質(zhì)激素對MLO-Y4骨樣細(xì)胞中MMPs的影響43-55
• 1. 材料與方法43-48
• 2. 結(jié)果48-50
• 3. 討論50-52
• 4. 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 全文結(jié)論55-56
• 致謝56-57
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文57-58
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表58

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