本文關鍵詞：TXNIP敲除對糖尿病小鼠腎損傷的影響及機制研究

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【摘要】：目的:糖尿病腎疾病(diabetic kidney disease,DKD)是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥,也是引起終末期慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)的主要原因。腎小管損傷是糖尿病腎疾病進程中的重要病理變化。關于預防和延緩糖尿病腎疾病的發(fā)生發(fā)展,保護腎功能,治療糖尿病腎疾病等方面仍然需要進一步的研究。已有研究證實,糖尿病時,腎臟中存在大量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)蓄積,破壞腎臟氧化還原的動態(tài)平衡,造成腎組織處于氧化應激狀態(tài),從而引起腎損傷的發(fā)生發(fā)展。體內(nèi)存在多種抗氧化系統(tǒng)清除ROS,如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶及維生素C等可修復氧化損傷。阻止ROS的過量蓄積已成為治療糖尿病腎疾病的有效途徑。硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)系統(tǒng)在對抗氧化應激方面起重要作用。TRX是一種巰基-氧化還原酶,能夠還原被氧化的蛋白,同時其自身的半胱氨酸殘基被氧化,此后,TRX又被NADPH依賴的硫氧還蛋白還原酶催化還原。這種作用維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的還原狀態(tài)使其發(fā)揮正常功能。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interaction protein,TXNIP)又稱硫氧還蛋白結(jié)合蛋白-2(thioredoxin binding protein-2,TBP-2)和維生素D3上調(diào)蛋白1(vitamin D3-upregulated protein 1,VDUP-1)。TXNIP是TRX的內(nèi)源性抑制蛋白,TXNIP與TRX活性位點結(jié)合而抑制TRX活性,間接調(diào)控細胞氧化還原狀態(tài)并且可誘導氧化應激的產(chǎn)生。許多研究表明,TXNIP在糖尿病相關模型中表達均明顯升高。敲低或敲除TXNIP可抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。TXNIP在葡萄糖誘導胰島β細胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用。敲低TXNIP表達能夠抑制高糖誘導的胰島β細胞的凋亡。我們前期研究顯示:高糖能夠誘導小鼠系膜細胞和腎小管細胞中TXNIP m RNA和蛋白表達水平均明顯升高,并且p38 MAPK信號通路參與了此過程;敲低TXNIP表達能夠增加高糖條件下細胞TRX活性和減少細胞內(nèi)ROS含量,同時抑制p38 MAPK和ERK1/2等信號的激活。以上研究提示:TXNIP可能在DKD發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。在本研究中我們采用野生型C57BL/6(Wild type,WT)小鼠和TXNIP基因敲除鼠(TXNIP knockout,TKO)進行實驗,利用STZ誘導小鼠糖尿病模型,觀察了TXNIP在糖尿病腎臟損傷中的作用以及作用機制,驗證TXNIP能否成為糖尿病腎疾病治療的新靶點。方法:動物實驗6~8周齡雄性WT小鼠(C57BL/6)和TKO小鼠(C57BL/6背景)隨機分為四組:WT對照組、WT+DM模型組、TKO+DM模型組、TKO對照組,每組8只。糖尿病模型建立采用多次小劑量STZ(50 mg/kg,溶于p H 4.5檸檬酸緩沖液)腹腔注射誘導建立小鼠Ⅰ型糖尿病模型。給藥前小鼠禁食12小時,連續(xù)給藥5天。給藥3天后測血糖,凡全血血糖≥16.7mmol/L,尿糖++~+++者確定為糖尿病模型。實驗期間兩周檢測一次血糖、體重。于造模成功后24周進行取材,收集血液及24小時尿液,用于生化指標檢測。小鼠稱重后進行取材,取部分腎組織放于4%多聚甲醛溶液中固定,用于組織切片制作,進行常規(guī)病理學觀察,免疫組織化學染色,免疫熒光染色和TUNEL染色檢測。取部分腎皮質(zhì)組織置于2.5%戊二醛固定,用于電子顯微鏡觀察。取部分腎皮質(zhì)組織置于液氮用于提取總RNA和總蛋白,觀察腎皮質(zhì)中相關檢測指標的m RNA和蛋白表達水平。結(jié)果:1敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎組織TXNIP的影響。與WT對照組相比,DM組小鼠腎組織中TXNIP表達明顯增高;與WT+DM組比較,TKO+DM組和TKO組小鼠腎臟中TXNIP表達缺失,這說明TXNIP敲除成功并且TXNIP敲除可改善糖尿病誘導的TXNIP過度表達。2敲除TXNIP改善糖尿病小鼠的一般情況。通過檢測與糖尿病腎病相關的常用生化指標顯示:與WT對照組相比,WT+DM小鼠體重減輕,血糖和24h尿蛋白高于正常。TXNIP敲除對DM小鼠的上述指標有所改善。3敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎臟病理變化的影響。腎小球光鏡PAS染色和MASSON染色發(fā)現(xiàn),與WT對照組相比,WT+DM組系膜區(qū)明顯增寬,細胞外基質(zhì)增多,部分腎小球毛細血管腔擴張。敲除TXNIP基因能夠改善上述糖尿病引起的腎病變。電鏡觀察顯示:WT+DM組腎小球部分足突融合消失,基底膜不規(guī)則增厚,系膜區(qū)增寬。與對照相比,ColI在WT+DM組腎小球表達明顯增高,TXNIP敲除能夠改善糖尿病誘導的ColI過度表達。4敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎臟凋亡及凋亡相關指標的影響。TUNEL法檢測結(jié)果顯示:與WT對照組相比,WT+DM組小鼠腎組織細胞凋亡數(shù)量明顯增高;與WT+DM組比較,TKO+DM組腎組織細胞凋亡數(shù)量明顯減少。與WT對照組相比,WT+DM組小鼠腎組織中Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3/caspase-3水平明顯增高;與WT+DM組比較,TKO+DM組Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3/caspase3明顯降低,這說明TXNIP敲除可以改善DM小鼠腎臟細胞的凋亡。5敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎組織α-SMA表達的影響。與WT對照組相比,WT+DM組小鼠腎組織中α-SMA表達明顯增高;與WT+DM組比較,TKO+DM組小鼠中α-SMA表達明顯降低,這說明TXNIP敲除可以明顯降低DM小鼠腎臟中α-SMA水平。6敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎臟氧化應激的影響。與WT對照組相比,WT+DM組小鼠腎組織中Nox4和尿中8-OHd G表達明顯增高;與WT+DM組比較,TKO+DM組腎組織中Nox4和尿中8-OHd G表達明顯降低,這說明TXNIP敲除可以明顯降低DM小鼠腎臟中氧化應激水平。7敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎臟p38 MAPK和ERK1/2信號通路激活的影響。與WT對照組相比,WT+DM組小鼠腎組織中p38 MAPK和ERK1/2磷酸化水平明顯增高;與WT+DM組比較,TKO+DM組小鼠腎組織中p38MAPK和ERK1/2磷酸化水平明顯降低。結(jié)論:1、在糖尿病小鼠腎臟中TXNIP表達明顯增加。2、敲除TXNIP能夠保護糖尿病小鼠腎功能,改善腎臟肥大和腎小管間質(zhì)纖維化。3、敲除TXNIP能夠抑制糖尿病腎臟細胞凋亡以及調(diào)控凋亡相關指標的表達。4、敲除TXNIP能夠抑制糖尿病腎臟p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化。5、敲除TXNIP對糖尿病腎疾病的保護作用可能是通過減少氧化應激實現(xiàn)的。
【關鍵詞】：糖尿病腎病 硫氧還蛋白相互作用蛋白 信號傳導 氧化應激 凋亡
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-12
• 英文縮寫12-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-26
• 結(jié)果26-28
• 附圖28-38
• 附表38-39
• 討論39-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-47
• 綜述 TXNIP在糖尿病疾病中的研究進展47-60
• 參考文獻53-60
• 致謝60-61
• 個人簡歷61

【參考文獻】

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1 Hui Yu;Xian-Xian Zhao;Xing-Hua Shan;Pan Li;Tao Chen;;Effect of thioredoxin-interacting protein on Wnt/β-catenin signaling pathway and diabetic myocardial infarction[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2015年11期

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本文編號：748386