本文關(guān)鍵詞：葛根素對成骨細(xì)胞miRNA-204的調(diào)控及其與Runx2基因表達(dá)的關(guān)系

  更多相關(guān)文章： 葛根素 增殖 成骨細(xì)胞 Runx2 miRNA-204

【摘要】：目的：研究葛根素對成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖能力、分化能力、miRNA表達(dá)的影響以及其與Runx2基因表達(dá)的關(guān)系。方法：1.MTT法檢測葛根素作用于MC3T3-E1細(xì)胞后成骨細(xì)胞的增殖能力,用終濃度為0.01mg/ml的葛根素處理,并設(shè)一個空白對照組,加入等體積的α-MEM培養(yǎng)液,每組設(shè)6個復(fù)孔分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后檢測OD值。2.堿性磷酸酶活性檢測葛根素對成骨細(xì)胞分化能力的影響,傳代培養(yǎng)成骨細(xì)胞后,進(jìn)行細(xì)胞爬片,等待細(xì)胞爬片成功后,棄掉培養(yǎng)液,用PBS清洗3次,依據(jù)ALP染色試劑盒說明書的方法,給細(xì)胞染色。3.葛根素作用于成骨細(xì)胞后,分別提取RNA和蛋白質(zhì),采用RT-PCR法檢測Runx2的mRNA表達(dá)水平和和用western blot法檢測Runx2蛋白表達(dá)水平。4.采用PicTar、Target Scan、等靶點(diǎn)預(yù)測軟件預(yù)測靶向Runx2的miRNA,并與表達(dá)譜測定的葛根素作用MC3T3-E1前后miRNA變化作比較。5.采用RT-PCR驗(yàn)證葛根素作用MC3T3-E1前后靶向Runx2基因的miRNA表達(dá)量。6.構(gòu)建Runx2 3'UTR/突變型Runx2 3'UTR重組質(zhì)粒、合成miRNA-204mimics和miRNA-204NC共轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞,用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗(yàn)證Runx2與miRNA-204的靶向關(guān)系。7.分別用miRNA-204inhibitor和miRNA-204mimics轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞,RT-PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染前后Runx2的mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果：葛根素作用后,與空白對照組比較：1.成骨細(xì)胞增殖能力提高；2.ALP活性提高；3.Runx2的mRNA和蛋白表達(dá)水平上升;4. miRNA表達(dá)譜和靶點(diǎn)預(yù)測軟件預(yù)測靶向Runx2的miRNA共同有miR-204、miRNA-344f-5p; 5.PCR結(jié)果顯示miRNA-204和miRNA-344f-5p表達(dá)水平下降,miRNA-2861表達(dá)水平上升,miRNA-23a-5p、 miRNA-770-5p、miRNA-871-5p表達(dá)水平無明顯改變；6.雙熒光素酶報告基因法結(jié)果顯示,細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,只有Runx2 3'UTR+miRNA-204 mimics組熒光素蛋白的表達(dá)水平顯著降低,說明只有miRNA-204可抑制Runx2 3'UTR報告基因的表達(dá)；7.過表達(dá)miRNA-204后Runx2的蛋白表達(dá)水平下降,干擾miRNA-204表達(dá)后Runx2的蛋白水平上升。結(jié)論：葛根素可提高成骨細(xì)胞增殖、分化能力,并調(diào)節(jié)可能靶向Runx2的miRNA,為進(jìn)一步研究葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞發(fā)育的機(jī)理研究提供可靠的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：葛根素 增殖 成骨細(xì)胞 Runx2 miRNA-204
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R580
【目錄】：

• 摘要8-9
• Abstract9-10
• 英文縮寫10-11
• 第一章 緒論11-14
• 研究背景11-13
• 研究內(nèi)容13
• 研究意義13-14
• 第二章 實(shí)驗(yàn)研究14-43
• 第一部分 中藥葛根對成骨細(xì)胞Runx2表達(dá)的影響14-23
• 實(shí)驗(yàn)一 MTT法檢測葛根素對成骨細(xì)胞增殖能力的影響14-15
• 1 材料14
• 2 方法14-15
• 3 數(shù)據(jù)分析15
• 4 結(jié)果15
• 5 討論15
• 實(shí)驗(yàn)二 堿性磷酸酶活性檢測葛根素對于成骨細(xì)胞活力影響15-17
• 1 材料16
• 2 方法16
• 3 數(shù)據(jù)分析16
• 4 結(jié)果16
• 5 討論16-17
• 實(shí)驗(yàn)三 qRT-PCR法檢測葛根素作用于成骨細(xì)胞后Runx2基因表達(dá)的影響17-20
• 1 材料17
• 2 方法17-18
• 3 數(shù)據(jù)分析18
• 4 結(jié)果18-19
• 5 討論19-20
• 實(shí)驗(yàn)四: Western blot法檢測葛根素對成骨細(xì)胞后Runx2蛋白表達(dá)水平的影響20-23
• 1 材料20
• 2 方法20-22
• 3 數(shù)據(jù)分析22
• 4 結(jié)果22-23
• 5 討論23
• 第二部分 靶向Runx2的microRNA的篩選和驗(yàn)證23-33
• 實(shí)驗(yàn)一 microRNA表達(dá)譜檢測葛根素作用成骨細(xì)胞后發(fā)生改變的microRNA23-25
• 1 材料23-24
• 2 方法24
• 3 結(jié)果24-25
• 4 討論25
• 實(shí)驗(yàn)二 靶向Runx2的microRNA的預(yù)測25-26
• 實(shí)驗(yàn)三 qRT-PCR驗(yàn)證葛根素作用后成骨細(xì)胞中可能靶向Runx2的miRNA的表達(dá)的變化26-30
• 1 材料27-28
• 2 方法28-29
• 3 數(shù)據(jù)處理29
• 4 結(jié)果29-30
• 5 討論30
• 實(shí)驗(yàn)四 構(gòu)建重組質(zhì)粒,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miRNA-204與Runx2的靶向關(guān)系30-33
• 1 材料30
• 2. 方法30-32
• 3 結(jié)果32-33
• 4 討論33
• 第三部分 轉(zhuǎn)染microRNA-204后對成骨細(xì)胞Runx2的表達(dá)的影響33-41
• 實(shí)驗(yàn)一 PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染microRNA-204對成骨細(xì)胞Runx2 mRNA的影響33-35
• 1 材料33-34
• 2 miRNA-204基因的過表達(dá)和干擾34
• 3 數(shù)據(jù)分析34
• 4. 結(jié)果34-35
• 5. 討論35
• 實(shí)驗(yàn)二 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染microRNA-204對成骨細(xì)胞Runx2 mRNA的影響35-38
• 1 材料35-36
• 2 方法36-37
• 3 數(shù)據(jù)分析37
• 4 結(jié)果37-38
• 5 討論38
• 實(shí)驗(yàn)三 MTT法檢測miRNA-204對成骨細(xì)胞增殖能力的影響38-40
• 1 材料38
• 2 方法38-39
• 3 數(shù)據(jù)分析39
• 4 結(jié)果39
• 5 討論39-40
• 實(shí)驗(yàn)四 堿性磷酸酶活性檢測轉(zhuǎn)染miRNA-204對成骨細(xì)胞活力的影響40-41
• 1 材料40
• 2 方法40
• 3 數(shù)據(jù)分析40
• 4 結(jié)果40-41
• 5 討論41
• 第四部分 總結(jié)41-43
• 綜述43-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 在校期間攻讀碩士學(xué)位學(xué)術(shù)成果54-55
• 致謝55

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王琴,盧集森;葛根素的臨床應(yīng)用新進(jìn)展[J];廣州醫(yī)藥;2001年04期

2 周志懷,李建芬,張增謙;葛根素的臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展[J];河北醫(yī)藥;2002年06期

3 蘇旭輝;葛根素的臨床應(yīng)用[J];張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2002年03期

4 金建軍,張中樂,王素玲,常永超;葛根素對肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2002年04期

5 張寧,馬建芳;葛根素的臨床應(yīng)用[J];海峽藥學(xué);2003年05期

6 趙軍;葛根素的臨床應(yīng)用[J];中國藥師;2003年09期

7 胡海濤;;葛根素治療糖尿病性周圍神經(jīng)病變[J];中國醫(yī)學(xué)文摘.內(nèi)科學(xué);2003年06期

8 黃光輝,劉惠芳;葛根素治療椎基底動脈供血不足35例[J];實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志;2004年03期

9 馮德輝;葛根素治療椎-基底動脈供血不足性眩暈療效觀察[J];中國中醫(yī)急癥;2004年05期

10 秦文,董興兵,楊勤;葛根素的臨床應(yīng)用新進(jìn)展[J];中國藥業(yè);2004年07期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 范津玲;;葛根素的臨床應(yīng)用進(jìn)展[A];新世紀(jì)全國中藥研究暨中藥房管理學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2001年

2 梁劍平;;葛根素提取工藝研究[A];第二屆中草藥提取關(guān)鍵技術(shù)與提取物產(chǎn)業(yè)應(yīng)用研討會論文集[C];2009年

3 陶志勛;;葛根素的臨床應(yīng)用進(jìn)展[A];2004年全國中藥研究暨中藥房管理學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2004年

4 趙紅;李成建;;葛根素不良反應(yīng)[A];第四屆全國老年醫(yī)學(xué)進(jìn)展學(xué)術(shù)會議論文集[C];2004年

5 屈凌波;王玲;陳曉嵐;趙玉芬;;7-磷酰化葛根素與牛血清蛋白的相互作用[A];第七屆全國磷化學(xué)化工暨第四屆海峽化學(xué)生物學(xué)、生物技術(shù)與醫(yī)藥發(fā)展討論會論文集[C];2006年

6 馬文紅;龔軍英;閆享福;鄭茜予;;葛根素的現(xiàn)代應(yīng)用概況(綜述)[A];2006第六屆中國藥學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文集[C];2006年

7 張立實(shí);丁曉琴;;葛根素的生物學(xué)作用及其應(yīng)用現(xiàn)狀[A];第二屆中國西部營養(yǎng)學(xué)術(shù)會議專題報告及論文摘要匯編[C];2006年

8 李洪玉;戴詩文;壽旦;章建民;;葛根中葛根素的高效液相色譜分析[A];第九屆全國中藥和天然藥物學(xué)術(shù)研討會大會報告及論文集[C];2007年

9 張立實(shí);;葛根素生物學(xué)作用研究進(jìn)展(綜述)[A];第四屆第二次中國毒理學(xué)會食品毒理學(xué)專業(yè)委員會與營養(yǎng)食品所毒理室聯(lián)合召開學(xué)術(shù)會議論文集[C];2008年

10 曲濤;周繡棣;慕宏杰;魏俊花;孫考祥;;樹枝狀聚合物聚酰胺-胺對葛根素在角膜上皮細(xì)胞攝取及滲透的影響[A];2011年中國藥學(xué)大會暨第11屆中國藥師周論文集[C];2011年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 副主任醫(yī)師 羅建國;葛根素可用治多種疾病[N];大眾衛(wèi)生報;2000年

2 李立安;葛根素的臨床新用[N];中國醫(yī)藥報;2002年

3 劉海文;葛根素治療糖尿病血管并發(fā)癥[N];中國醫(yī)藥報;2005年

4 陶春祥;葛根素的臨床應(yīng)用[N];中國中醫(yī)藥報;2002年

5 王利；魏品康；秦志豐;研究揭示：葛根素可解決腫瘤MDR難題[N];中國醫(yī)藥報;2005年

6 常怡勇;注意葛根素的不良反應(yīng)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2004年

7 楊嘉珍邋歐陽作憲;葛根素對腦細(xì)胞損傷有保護(hù)作用[N];中國中醫(yī)藥報;2008年

8 楊衛(wèi)彬;葛根素治療強(qiáng)直性脊柱炎的臨床觀察[N];中國中醫(yī)藥報;2004年

9 程書權(quán);葛根素的臨床應(yīng)用[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

10 青云;葛根素制劑的研究[N];中國醫(yī)藥報;2003年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張靜;葛根素對慢性缺血誘發(fā)的血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

2 曾艷平;葛根素聯(lián)合5-FU對肝癌細(xì)胞SMMC7721作用的研究[D];武漢大學(xué);2015年

3 楊希;葛根素作為牙周炎宿主調(diào)節(jié)治療藥物的研究[D];武漢大學(xué);2015年

4 張衛(wèi)國;葛根素對人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2016年

5 張建武;葛根素水凝膠在MSCs移植治療心肌梗死中的作用及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

6 李耿;克服溶血的復(fù)方葛根素注射制劑生物評價研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2009年

7 潘洪平;葛根素的吸收動力學(xué)及對腦缺血損傷的保護(hù)作用研究[D];華中科技大學(xué);2010年

8 羅承鋒;葛根素固體脂質(zhì)納米粒的藥動學(xué)及其代謝產(chǎn)物研究[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2010年

9 吳純潔;葛根素眼用新型給藥系統(tǒng)的研究[D];四川大學(xué);2005年

10 李翼飛;葛根素特異性敲除技術(shù)方法及應(yīng)用研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 閆春林;葛根素對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過程中p53及相關(guān)基因表達(dá)的影響[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

2 陳貴洪;地塞米松聯(lián)合葛根素治療急性百草枯中毒大鼠的實(shí)驗(yàn)研究[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

3 粟鳳;葛根素預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[D];貴陽醫(yī)學(xué)院;2015年

4 康鑫;葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及信號調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘭州大學(xué);2015年

5 賴松青;葛根素抗大鼠離體心臟缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究[D];南昌大學(xué);2013年

6 孫艷;葛根素下調(diào)組織蛋白酶B抑制TGF-β誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡的研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2015年

7 周禮仕;芪燈明目膠囊化學(xué)成分分析與質(zhì)量控制研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2015年

8 金鑫;葛根素聯(lián)用沙格列汀對糖尿病大鼠血糖、腎臟纖維化及高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的影響[D];皖南醫(yī)學(xué)院;2015年

9 國海東;葛根素高效檢測、分離及穩(wěn)定性和增溶研究[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 施榮楓;利用免疫分析法解析葛根素在正常大鼠和MCAO模型大鼠中的藥代動力學(xué)特征[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

，

本文編號：694535