葛根素對成骨細胞miRNA-204的調(diào)控及其與Runx2基因表達的關系
本文關鍵詞:葛根素對成骨細胞miRNA-204的調(diào)控及其與Runx2基因表達的關系
更多相關文章: 葛根素 增殖 成骨細胞 Runx2 miRNA-204
【摘要】:目的:研究葛根素對成骨細胞MC3T3-E1增殖能力、分化能力、miRNA表達的影響以及其與Runx2基因表達的關系。方法:1.MTT法檢測葛根素作用于MC3T3-E1細胞后成骨細胞的增殖能力,用終濃度為0.01mg/ml的葛根素處理,并設一個空白對照組,加入等體積的α-MEM培養(yǎng)液,每組設6個復孔分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后檢測OD值。2.堿性磷酸酶活性檢測葛根素對成骨細胞分化能力的影響,傳代培養(yǎng)成骨細胞后,進行細胞爬片,等待細胞爬片成功后,棄掉培養(yǎng)液,用PBS清洗3次,依據(jù)ALP染色試劑盒說明書的方法,給細胞染色。3.葛根素作用于成骨細胞后,分別提取RNA和蛋白質(zhì),采用RT-PCR法檢測Runx2的mRNA表達水平和和用western blot法檢測Runx2蛋白表達水平。4.采用PicTar、Target Scan、等靶點預測軟件預測靶向Runx2的miRNA,并與表達譜測定的葛根素作用MC3T3-E1前后miRNA變化作比較。5.采用RT-PCR驗證葛根素作用MC3T3-E1前后靶向Runx2基因的miRNA表達量。6.構建Runx2 3'UTR/突變型Runx2 3'UTR重組質(zhì)粒、合成miRNA-204mimics和miRNA-204NC共轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞,用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證Runx2與miRNA-204的靶向關系。7.分別用miRNA-204inhibitor和miRNA-204mimics轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞,RT-PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染前后Runx2的mRNA表達量和蛋白表達量的變化。結果:葛根素作用后,與空白對照組比較:1.成骨細胞增殖能力提高;2.ALP活性提高;3.Runx2的mRNA和蛋白表達水平上升;4. miRNA表達譜和靶點預測軟件預測靶向Runx2的miRNA共同有miR-204、miRNA-344f-5p; 5.PCR結果顯示miRNA-204和miRNA-344f-5p表達水平下降,miRNA-2861表達水平上升,miRNA-23a-5p、 miRNA-770-5p、miRNA-871-5p表達水平無明顯改變;6.雙熒光素酶報告基因法結果顯示,細胞轉(zhuǎn)染48h后,只有Runx2 3'UTR+miRNA-204 mimics組熒光素蛋白的表達水平顯著降低,說明只有miRNA-204可抑制Runx2 3'UTR報告基因的表達;7.過表達miRNA-204后Runx2的蛋白表達水平下降,干擾miRNA-204表達后Runx2的蛋白水平上升。結論:葛根素可提高成骨細胞增殖、分化能力,并調(diào)節(jié)可能靶向Runx2的miRNA,為進一步研究葛根素促進成骨細胞發(fā)育的機理研究提供可靠的依據(jù)。
【關鍵詞】:葛根素 增殖 成骨細胞 Runx2 miRNA-204
【學位授予單位】:南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2016
【分類號】:R580
【目錄】:
- 摘要8-9
- Abstract9-10
- 英文縮寫10-11
- 第一章 緒論11-14
- 研究背景11-13
- 研究內(nèi)容13
- 研究意義13-14
- 第二章 實驗研究14-43
- 第一部分 中藥葛根對成骨細胞Runx2表達的影響14-23
- 實驗一 MTT法檢測葛根素對成骨細胞增殖能力的影響14-15
- 1 材料14
- 2 方法14-15
- 3 數(shù)據(jù)分析15
- 4 結果15
- 5 討論15
- 實驗二 堿性磷酸酶活性檢測葛根素對于成骨細胞活力影響15-17
- 1 材料16
- 2 方法16
- 3 數(shù)據(jù)分析16
- 4 結果16
- 5 討論16-17
- 實驗三 qRT-PCR法檢測葛根素作用于成骨細胞后Runx2基因表達的影響17-20
- 1 材料17
- 2 方法17-18
- 3 數(shù)據(jù)分析18
- 4 結果18-19
- 5 討論19-20
- 實驗四: Western blot法檢測葛根素對成骨細胞后Runx2蛋白表達水平的影響20-23
- 1 材料20
- 2 方法20-22
- 3 數(shù)據(jù)分析22
- 4 結果22-23
- 5 討論23
- 第二部分 靶向Runx2的microRNA的篩選和驗證23-33
- 實驗一 microRNA表達譜檢測葛根素作用成骨細胞后發(fā)生改變的microRNA23-25
- 1 材料23-24
- 2 方法24
- 3 結果24-25
- 4 討論25
- 實驗二 靶向Runx2的microRNA的預測25-26
- 實驗三 qRT-PCR驗證葛根素作用后成骨細胞中可能靶向Runx2的miRNA的表達的變化26-30
- 1 材料27-28
- 2 方法28-29
- 3 數(shù)據(jù)處理29
- 4 結果29-30
- 5 討論30
- 實驗四 構建重組質(zhì)粒,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miRNA-204與Runx2的靶向關系30-33
- 1 材料30
- 2. 方法30-32
- 3 結果32-33
- 4 討論33
- 第三部分 轉(zhuǎn)染microRNA-204后對成骨細胞Runx2的表達的影響33-41
- 實驗一 PCR驗證轉(zhuǎn)染microRNA-204對成骨細胞Runx2 mRNA的影響33-35
- 1 材料33-34
- 2 miRNA-204基因的過表達和干擾34
- 3 數(shù)據(jù)分析34
- 4. 結果34-35
- 5. 討論35
- 實驗二 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染microRNA-204對成骨細胞Runx2 mRNA的影響35-38
- 1 材料35-36
- 2 方法36-37
- 3 數(shù)據(jù)分析37
- 4 結果37-38
- 5 討論38
- 實驗三 MTT法檢測miRNA-204對成骨細胞增殖能力的影響38-40
- 1 材料38
- 2 方法38-39
- 3 數(shù)據(jù)分析39
- 4 結果39
- 5 討論39-40
- 實驗四 堿性磷酸酶活性檢測轉(zhuǎn)染miRNA-204對成骨細胞活力的影響40-41
- 1 材料40
- 2 方法40
- 3 數(shù)據(jù)分析40
- 4 結果40-41
- 5 討論41
- 第四部分 總結41-43
- 綜述43-48
- 參考文獻48-54
- 在校期間攻讀碩士學位學術成果54-55
- 致謝55
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