本文關鍵詞：2型糖尿病外周血LncRNAs表達譜改變與胰島功能相關性的研究

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【摘要】：研究背景在我國,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的發(fā)病率呈現(xiàn)出高速發(fā)展趨勢,據(jù)2013年發(fā)表在JAMA的研究表明,我國T2DM的患病率已達到11.6%,總患病人數(shù)達1.14億,躍居世界第一位,已成為繼腫瘤、心血管病變之后的第三大嚴重威脅人們健康的慢性病。預計到2025年,我國罹患糖尿病人數(shù)將達3億之多,嚴重影響人類的生命健康和社會的發(fā)展。糖尿病高危的遺傳背景加上外在的環(huán)境因素,最終將導致胰島p細胞功能缺陷。由于遺傳背景不同,人群中存在對2型糖尿病相對易感人群,在同等條件下,他們更容易患2型糖尿病,臨床上稱之為“遺傳易感性”。這與相關基因表達異常有關,而對于累積的相關基因表達異常是否已經發(fā)展到“臨界點”,僅憑空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)或者餐后血糖(postprandial plasma glucose, PPG)等外在表型來間接判斷并不可靠,因此深入探索糖尿病易感基因及表達改變情況,認識其發(fā)病機理,對糖尿病的早期診斷和個體化治療具有重要意義。非編碼RNA (non-coding RNA)近來成為生命科學中的研究熱點,被稱為生命體中的“暗物質”,廣泛參與人體病理生理活動,其調控失衡可參與眾多疾病的發(fā)生。非編碼RNA是一大類不編碼蛋白質,但在細胞中起著調控作用的基因分子。大量研究表明,一系列重大疾病的發(fā)生發(fā)展與非編碼RNA的調控失衡相關。其中,長鏈非編碼RNA (lncRNA)是轉錄本長度超過200個核苷酸單位的非編碼RNA分子,廣泛參與機體幾乎所有的生理和病理過程,可通過與相應的靶基因形成復合體,促進或抑制靶基因的降解、翻譯等過程,在表觀遺傳水平、轉錄水平及轉錄后水平等多種層面上調控基因的表達。近年研究提出,lncRNAs的異常表達與腫瘤、心血管疾病、感染、神經系統(tǒng)疾病以及糖尿病等復雜疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關,具有促進或抑制疾病發(fā)生的作用。如某些組織特異的lncRNAs差異表達于正常組織、不典型增生組織或腫瘤組織中,可作為腫瘤的預測因子。lncRNAs也存在于人的循環(huán)血液系統(tǒng)中,并能夠從外周血中穩(wěn)定檢測：如前列腺癌特異的lncRNA DD3(也稱為PCA3)已被發(fā)展為高度特異性的核酸分子標志物,且特異性高于血清前列腺癌特異性抗原(PSA)。目前,lncRNAs在腫瘤等領域的研究方興未艾,但有關lncRNAs與2型糖尿病發(fā)生機制的研究仍處于起步階段,特別是其在2型糖尿病患者外周血中的表達情況尚未見報道。初步研究揭示lncRNAs與β細胞發(fā)育、增殖,胰島素的產生等密切相關,提示lncRNAs可能參與調控胰島β細胞功能缺陷及2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程。另一方面,由于T2DM患者的胰島組織標本極難獲得,因此如果外周血lncRNA能夠作為臨床標記物應用,這對于T2DM患者具有更為顯著的意義。綜上,本研究擬通過lncRNA基因芯片構建2型糖尿病患者外周血差異表達的lncRNA表達譜,篩選和鑒定與T2DM發(fā)生和發(fā)展密切相關的lncRNA,并通過生物信息學分析目的基因的功能。通過橫斷面研究進一步分析2型糖尿病中差異表達的lncRNA與胰島功能的相關性,以期為T2DM早期診斷及治療提供新的策略。本課題分以下兩部分：第一章2型糖尿病差異表達lncRNAs的鑒定和功能研究目的通過lncRNA基因芯片分析2型糖尿病(T2DM)患者和健康對照組的外周血中差異表達的長鏈非編碼RNA(lncRNA)和mRNA。運用生物學功能聚類、KEGG信號通路分析挑選與2型糖尿病胰島素信號通路密切相關的lncRNAs。通過進一步構建lncRNA-mRNA調控網絡及靶基因預測,分析差異表達的lncRNAs在2型糖尿病發(fā)病過程中可能參與的調控機制。方法1、收集性別、年齡相匹配的新診斷2型糖尿病患者及健康對照患者外周血樣本各3例,記錄受試者一般資料,分離提取總RNA。2、采用lncRNAs表達譜芯片檢測2型糖尿病患者差異表達的lncRNAs及mRNA,以差異倍數(shù)(FC值)大于或等于2,且p0.05為標準,篩選出2型糖尿病組與健康對照組比較存在差異表達的lncRNAs和mRNA。3、采用生物信息學分析挑選與胰島素信號通路相關的lncRNAs,預測其靶基因,構建IncRNAs-mRNA共表達網咯：應用ENCODE數(shù)據(jù),采用GO與KEGG Pathway聚類,對差異基因可能富集的生物信息學功能進行分析,挑選與胰島素信號通路相關的lncRNAs。利用pearson相關系數(shù)預測差異表達的lncRNA及共表達的mRNA,并在lncRNA和mRNA共表達的基礎上通過順式(cis-)預測和反式(trans-)預測候選基因的靶基因。cis-預測尋找位于基因組位置的10kb以內的lncRNA-mRNA對；trans-預測借助Blat工具,比較lncRNA和mRNA(3'UTR)的序列,進而篩選序列相似的lncRNA-mRNA對。結果1、lncRNA芯片結果分析顯示,2型糖尿病患者組和健康對照比較存在2270個顯著差異的lncRNAs,其中1891個lncRNAs表達上調,379個lncRNAs表達下調；有2194個顯著差異的mRNA,其中653個mRNA表達下調,1541個mRNA表達下調。2、對2型糖尿病患者外周血中差異表達的基因進行生物信息學分析：GO功能分析表明,差異表達lncRNA與轉錄調控、RNA代謝過程調控、RNA基因沉默、細胞表面受體信號轉錄、免疫應答、防御反應、細胞增殖、細胞凋亡等功能相關。KEGG信號通路分析表明,lncRNA相關mRNA轉錄本的信號通路主要富集在Jak-STAT信號通路、胰島素信號通路、腫瘤相關信號通路以及Toll樣受體信號通路等。(p0.01)。從中挑選與胰島素信號通路相關,且差異表達最顯著的前六位基因,分別為Inc-p3134, lnc-p25201, lnc-p34005_v4, Inc-p18324, Inc-p12792, lnc-RNA143599進一步分析其表達水平與2型糖尿病糖脂代謝和胰島功能的相關性。3、運用生物信息學分析發(fā)現(xiàn),lnc-p 12792與23個mRNA存在共表達,并且這些mRNA與胰島素信號通路密切相關。通過靶基因預測軟件,發(fā)現(xiàn)轉錄因子類似物2 (TCF7L2)基因是Inc-p12792基因的調控靶標。TCF7L2是被確認的2型糖尿病易感基因,且被證實是與糖代謝障礙關聯(lián)性最強的蛋白編碼基因,與葡萄糖誘導的胰島素分泌密切相關。TCF7L2可影響胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的合成來阻斷胰島素信號通路,誘導胰島素分泌缺陷或胰島細胞功能障礙。結論2型糖尿病患者外周血中存在差異表達的長鏈非編碼RNA,參與轉錄調控、RNA代謝過程調控、RNA基因沉默等過程,主要涉及多種信號通路調控,其中l(wèi)ncRNA-p12792及其靶基因TCF7L2涉及胰島素信號相關通路,可能參與調控T2DM的發(fā)生發(fā)展過程,提示incRNA-p 12792可能是潛在的2型糖尿病的分子標志物。第二章2型糖尿病相關IncRNAs與胰島p細胞功能的相關性研究目的探討6個糖尿病相關的lncRNAs(lnc-p3134, lnc-p25201, lnc-p34005_v4, Inc-p18324, Inc-p12792, lnc-RNA143599)在2型糖尿病患者外周血中的表達情況,及其與糖、脂代謝指標及胰島p細胞功能的相關性,為T2DM早期診斷及胰島功能評估尋找新的生物標志物。方法1、收集新診斷2型糖尿病及健康對照組患者外周血樣本各30例,記錄受試者一般資料,分離提取總RNA。2、采用實時熒光PCR驗證候選lncRNAs的相對表達水平：結合芯片及生物信息學分析結果,選取與胰島素信號通路相關的lncRNAs,并從中挑選差異表達最顯著的前六位基因,采用real-time PCR技術,驗證2型糖尿病組(n=30)及健康對照組(n=30)外周血差異基因的表達水平,采用兩獨立樣本t檢驗比較兩組差異基因的表達水平。3、檢測兩組患者的體重指數(shù)(body mass index,BMI),腰臀比,行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT),采用葡萄糖氧化酶法檢測空腹及75g葡萄糖負荷后2小時血糖,采用化學微粒子免疫法檢測空腹及餐后2小時胰島素,采用放射免疫測定法檢測空腹及餐后2小時C肽,采用穩(wěn)態(tài)模型胰島素分泌指數(shù)(HOMA-p)評估胰島β細胞胰島素分泌功能,穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)評價胰島素抵抗水平,采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測白介素6 (interleukin 6,IL-6)、超敏C反應蛋白(hyper-sensitive C-reactive protein, hsCRP)的水平,全自動生化分析儀檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),采用Spearman相關分析及多元逐步回歸分析差異表達的lncRNAs與相關代謝指標及胰島功能的相關性,采用ROC曲線評估目的基因在2型糖尿病中的診斷價值。結果1、與正常對照組相比,2型糖尿病患者外周血中Inc-p3134, lnc-p25201, lnc-p 18324, lnc-p 12792,以及l(fā)nc-RNA143599表達顯著高于正常對照組,lnc-p34005_v4表達顯著低于正常對照組(P均0.01),PCR驗證結果與基因芯片結果一致。2. Spearman相關分析表明,Inc-p3134與年齡、腰臀比、FBG、空腹C肽、HOMA-IR、TG、LDL-C呈正相關(p均0.05),與HOMA-p呈負相關(r=-0.412,p0.05),與BMI、空腹胰島素、TC. HDL-C、IL-6、hsCRP無相關性(p均0.05)；lnc-p 12792與BMI、腰臀比、FBG、TC呈正相關(p均0.05),與HOMA-β呈負相關(r=-0.484,p0.05),與年齡、空腹胰島素、空腹C肽、HOMA-IR、TG、LDL-C、HDL-C、IL-6. hsCRP無相關性(p均0.05)；lnc-RNA143599與年齡、BMI、腰臀比、FBG、空腹C肽、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C呈正相關(p均0.05),與HOMA-β (r=-0.398)、 HDL-C呈負相關(p均0.05),與空腹胰島素、IL-6、hsCRP無相關性(p均0.05)；lnc-p25201與腰臀比、FBG、HOMA-IR、TG呈正相關,與其余指標無相關性(p均0.05)；Inc-p18324 與 FBG、HOMA-IR、hsCRP、TG呈正相關(p均0.05),與其余指標無相關性(p均0.05)；lnc-p34005_v4與年齡及FBG呈負相關(p均0.05),與其余指標無相關性(p均0.05)。3、多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),外周血Inc-p12792表達水平高的個體,糖尿病發(fā)病風險顯著上升,矯正OR值為1.96。多元逐步回歸分析結果顯示,FBG(P=0.394, p0.01)、BMI(β=0.379, p0.01)以及HOMA-P(p=-0.391, p0.01)是影響外周血lnc-p12792的獨立因素。通過對血糖水平進行分層,進一步發(fā)現(xiàn)隨著空腹血糖水平逐漸升高,外周血lnc-p12792的表達水平也逐漸升高,各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(p均0.05)。采用ROC曲線評估lnc-p12792基因在2型糖尿病中的診斷價值,敏感性為66.7%,特異性為83.3%。結論2型糖尿病患者外周血中Inc-p3134, lnc-p25201, Inc-p18324, Inc-p12792,以及l(fā)nc-RNA143599表達顯著升高,lnc-p34005_v4表達顯著降低。其中Inc-p12792是2型糖尿病發(fā)病的獨立危險因素,與BMI、空腹血糖和HOMA-β水平顯著相關,推測其上調可能與糖、脂毒性誘導的胰島p細胞功能缺陷有關,對2型糖尿病的發(fā)生有預測意義。
【關鍵詞】：2型糖尿病 胰島功能 基因芯片 長鏈非編碼RNA
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-25
• 參考文獻22-25
• 第一部分 2型糖尿病差異表達lncRNAs的鑒定和功能研究25-56
• 1.1 對象和方法25-38
• 1.2 結果38-48
• 1.3 討論48-51
• 1.4 小結51-52
• 參考文獻52-56
• 第二部分 2型糖尿病相關lncRNAs與胰島β細胞功能的相關性研究56-79
• 2.1 對象和方法56-64
• 2.2 結果64-72
• 2.3 討論72-75
• 2.4 小結75
• 參考文獻75-79
• 結論79-80
• 創(chuàng)新性評價80-81
• 攻讀學位期間成果81-82
• 致謝82-83

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王香梅;彭智;;lncRNAs的分子功能及其在干細胞多能性中的研究進展[J];齊齊哈爾醫(yī)學院學報;2012年24期

2 ;[J];;年期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 阮玉婷;2型糖尿病外周血LncRNAs表達譜改變與胰島功能相關性的研究[D];南方醫(yī)科大學;2016年

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本文編號：637813