本文關(guān)鍵詞：去泛素化酶CYLD對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎系膜細(xì)胞NF-KB炎癥信號(hào)的調(diào)控研究

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【摘要】：目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病特有而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,也是西方國(guó)家終末腎病(end stage renal defailure,ESRD)產(chǎn)生并最終依靠腎透析維持生命的主要原因。大量研究顯示,在糖尿病腎病早期腎組織中即見到單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、核因子κB(NF-κB)等炎癥因子產(chǎn)生增加,提示糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展與炎癥有密切關(guān)聯(lián),而NF-κB在炎癥反應(yīng)中具有重要作用。在所有炎癥反應(yīng)中均可以發(fā)現(xiàn)NF-κB活性增高,當(dāng)抑制其活性以后炎癥的病理過程則被阻止。我們前期研究已證實(shí)了泛素化修飾在對(duì)高糖誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)的活化中有重要調(diào)節(jié)作用。然而NF-κB信號(hào)的調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜,泛素化修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程,NF-κB信號(hào)通路也受到去泛素化修飾的調(diào)節(jié)。在眾多調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)去泛素化酶中,去泛素化酶圓柱瘤蛋白(cylindromatosis,CYLD)是NF-κB信號(hào)的主要負(fù)性調(diào)控因子和炎癥抑制因子之一。目前有關(guān)CYLD與糖尿病腎病的研究卻鮮有報(bào)道。為此,本研究首先通過觀察高糖刺激后小鼠腎系膜細(xì)胞CYLD、總IKBα、p-IKBα、p-NF-κB p65、IKKγ、MCP-1、IL-6、IL-8表達(dá)變化,然后分別沉默和過表達(dá)CYLD基因,檢測(cè)高糖誘導(dǎo)的NF-κB通路中總的IKBα、p-IKBα、IKKγ、p-NF-κB p65及下游炎癥因子MCP-1、IL-6、IL-8的表達(dá),探討去泛素化酶CYLD在糖尿病腎病NF-KB信號(hào)通路激活中的調(diào)控作用。方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng)及分組:體外培養(yǎng)小鼠腎系膜細(xì)胞,以高糖作為刺激因子,再分別沉默及過表達(dá)cyld基因,實(shí)驗(yàn)分組設(shè)為:1.正常對(duì)照組(nc組):培養(yǎng)基含葡萄糖5.6mmol/l;2.高糖干預(yù)組(hg1、hg2、和hg3組):培養(yǎng)基含葡萄糖濃度分別為10、20、30mmol/l;3.甘露醇組(op組):含5.6mmol/l葡萄糖以及24.4mmol/l的甘露醇保持總滲透壓在30mmol/l;4.cyldsirna干擾組:培養(yǎng)基內(nèi)含100nmol/lcyldsirna干擾序列;5.cyld過表達(dá)組:培養(yǎng)基內(nèi)含過表達(dá)cyld目的基因的滴度為1*108tu/ml,moi值為50的慢病毒;6.空載體組:培養(yǎng)基內(nèi)含不帶有cyld目的基因的滴度為1*108tu/ml,moi值為50的陰性對(duì)照病毒con235。(2)各組分別作用6h、12h、24h、48h、72h后用蛋白免疫印跡、rt-pcr法檢測(cè)cyld、總iκbα、p-nf-κbp65、p-iκbα、ikkγ表達(dá),用elisa法檢測(cè)nf-κb下游炎癥因子mcp-1、il-6、il-8的表達(dá)水平。(3)用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(??±s)來表示,各組間比較用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn),p0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、與nc組比較,高糖刺激使各組系膜細(xì)胞的cyld、總量iκbα蛋白和mrna表達(dá)減弱(p0.05),而p-iκbα、p-nf-κbp65和mcp-1、il-6、il-8表達(dá)增強(qiáng)(p0.05)且具有時(shí)間、濃度依賴性;2、高糖刺激對(duì)ikkγ蛋白和mrna表達(dá)水平無明顯影響(p0.05);3、使用sirna干擾cyld,再用高糖刺激后,iκbα總蛋白表達(dá)進(jìn)一步減弱,而p-iκbα、p-nf-κbp65和mcp-1表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。4、過表達(dá)cyld慢病毒轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞,再用高糖刺激后iκbα總蛋白表達(dá)水平增高,信號(hào)分子p-IκBα、p-NF-κB P65蛋白和MCP-1、IL-6、IL-8表達(dá)減弱,提示CYLD在高糖狀態(tài)下可負(fù)性調(diào)控NF-κB信號(hào)通路。結(jié)論:1、高糖可激活NF-κB信號(hào)通路而介導(dǎo)下游炎癥因子MCP-1、IL-6、IL-8表達(dá)參與腎臟炎癥發(fā)生;2、去泛素化酶CYLD能負(fù)性調(diào)控高糖誘導(dǎo)的NF-κB炎癥信號(hào)。3、高糖可通過下調(diào)CYLD的表達(dá)參與腎系膜細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路的激活,去泛素化酶CYLD的下調(diào)可能是糖尿病腎病炎癥發(fā)病的又一重要機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病腎病 去泛素化酶CYLD 核因子κB 炎癥
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-13
• 材料與方法13-35
• 結(jié)果35-57
• 討論57-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 英漢縮略對(duì)照表70-71
• 致謝71-72
• CYLD和NF-κB相關(guān)研究進(jìn)展(綜述)72-86
• 參考文獻(xiàn)82-86

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本文編號(hào)：607604