本文關鍵詞：FTZ含藥血清改善氧化應激引起的INS-1胰島β細胞損傷的作用及機制探究

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【摘要】：研究背景:糖尿病是一組由于胰島素抵抗及(或)胰島素分泌缺陷引起的以高血糖為特征的代謝性疾病,已成為當前威脅人類健康的最重要的非傳染性疾病之一。持續(xù)高血糖對胰島β細胞的損傷在2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用越來越受關注。高血糖引起的氧化應激是導致胰島β細胞損傷的主要原因之一。本實驗室前期研究表明,復方貞術調脂膠囊(Fu fang Zhen shu Tiao zhi Capsule,FTZ)具有降糖、降脂、抗凝、抗炎、保護血管內皮細胞等作用,能同時干預脂質的吸收、合成、轉化、轉運、分解、排泄等多個環(huán)節(jié),對動脈粥樣硬化、高脂血癥、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病具有很好的防治作用。但FTZ是否具有改善氧化應激引起的胰島β細胞損傷、維持胰島β細胞正常的功能和數量的作用尚不清楚。目的:1、探究FTZ含藥血清改善高糖引起的氧化應激對INS-1胰島β細胞損傷的作用及機制。2、探究FTZ含藥血清改善氧化應激引起的INS-1胰島β細胞凋亡的作用及機制。3、探究FTZ含藥血清促進葡萄糖刺激的胰島β細胞胰島素釋放的作用及機制。方法:1、將40只健康雄性SD大鼠平均分為2組,即給藥組和空白組。大鼠禁食18h后灌胃FTZ混懸液,劑量為3 g提取物/kg體重�？瞻捉M灌予超純水。連續(xù)灌胃3天,一天2次,末次灌胃1 h后腹主動脈取血。血液室溫靜止1h后離心處理(3000 r/min,15 min/次,2次),分離后合并同組大鼠血清,置水浴鍋中,由室溫開始升溫至56℃,并維持30min。0.22μm濾膜過濾,制得ftz含藥血清和大鼠空白血清。對ftz原料藥、ftz含藥血清、大鼠空白血清分別進行uplc/q-tof-ms分析。2、培養(yǎng)ins-1胰島β細胞并進行分組,分別為對照組(control組),模型組(model組),陽性藥物組(edaravone組),血清對照組(10%rat-serum組),低劑量含藥血清組(0.4%ftz-serum組)、中劑量含藥血清組(2%ftz-serum)和高劑量含藥血清組(10%ftz-serum組)。control組細胞使用含有11mmol/l葡萄糖溶液和10%fbs的rpmi1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng);model組細胞使用含25mmol/l葡萄糖溶液和10%fbs的rpmi1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng);edaravone組細胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液、200μmol/ledaravone和10%fbs的rpmi1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng);10%rat-serum組細胞使用含25mmol/l葡萄糖溶液和10%大鼠空白血清的rpmi1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng);0.4%ftz-serum組細胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液、0.4%ftz含藥血清和9.6%大鼠空白血清的rpmi1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng);2%ftz-serum組細胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液、2%ftz含藥血清和8%大鼠空白血清的rpmi1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng);10%ftz-serum組細胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液和10%ftz含藥血清的rpmi1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng),給藥后,均培養(yǎng)48h。3、采用dcfh-da熒光探針試劑盒檢測細胞內的ros水平;mda檢測試劑盒檢測細胞內脂質過氧化水平;提取細胞總蛋白,采用westernblot方法檢測細胞內mn-sod、cat蛋白表達水平。4、采用annexinv-fitc細胞凋亡檢測試劑盒通過流式細胞儀測定ins-1胰島β細胞的凋亡率;采用caspase9活性檢測試劑盒和caspase3活性檢測試劑盒分別檢測ins-1胰島β細胞內凋亡蛋白酶caspase9和caspase3的活性;提取細胞總蛋白,采用westernblot方法檢測細胞內的抗凋亡蛋白bcl-2/bcl-xl及促凋亡蛋白bax的蛋白表達水平。5、采用ratinsulinelisa試劑盒檢測ins-1胰島β細胞中葡萄糖刺激的胰島素釋放濃度;提取細胞總蛋白,采用westernblot方法檢測細胞內pdx-1和glut2蛋白表達水平。結果:1、ftz原料藥、ftz含藥血清、大鼠空白血清的uplc/q-tof-ms圖譜結果顯示,FTZ含藥血清含有一定濃度的藥物成分,大鼠空白血清中不含有藥物成分。2、與Control組細胞相比,Model組細胞內的ROS、MDA濃度顯著上升;Mn-SOD、CAT蛋白表達水平顯著下降。與Model組細胞相比,FTZ含藥血清可顯著降低細胞內ROS和MDA濃度,提高Mn-SOD、CAT的蛋白表達量。3、與Control組細胞相比,Model組細胞的抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表達量沒有明顯的變化,但是促凋亡蛋白Bax的蛋白表達量顯著提高,細胞內凋亡蛋白酶caspase 9和caspase 3的活性顯著提高,細胞的凋亡率顯著上升。與Model組細胞相比,FTZ含藥血清可顯著提高細胞的抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表達量,降低促凋亡蛋白Bax的蛋白表達量,10%的FTZ含藥血清還可顯著降低細胞凋亡蛋白酶caspase 9和caspase 3的活性,不同濃度的FTZ含藥血清均可顯著降低細胞的凋亡率。4、與Control組細胞相比,Model組細胞的PDX-1和Glut 2蛋白表達量顯著下降,葡萄糖刺激的胰島素釋放濃度也顯著降低。與Model組細胞相比,FTZ含藥血清可顯著提高細胞的PDX-1和Glut 2蛋白表達量,2%和10%FTZ含藥血清可明顯提高細胞中葡萄糖刺激的胰島素釋放濃度。結論:1、FTZ含藥血清可通過降低細胞內ROS和MDA濃度,提高Mn-SOD和CAT蛋白表達量,改善高糖引起的氧化應激損傷;2、FTZ含藥血清可通過提高細胞內抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表達量,抑制促凋亡蛋白Bax的蛋白表達量,降低細胞內caspase 9和caspase 3的活性,改善氧化應激引起的細胞凋亡;3、FTZ含藥血清可通過提高細胞內PDX-1和Glut 2蛋白表達量,提高葡萄糖刺激的胰島素釋放濃度,改善氧化應激引起的胰島素釋放功能受損。
【關鍵詞】：FTZ含藥血清 胰島β細胞 氧化應激 細胞凋亡 胰島素
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 第一章 緒論14-21
• 1.氧化應激與2型糖尿病14-19
• 1.1 氧化應激的標志物及其測定15-16
• 1.2 氧化應激與胰島 β 細胞16-18
• 1.3 氧化應激與胰島素抵抗18
• 1.4 小結18-19
• 2.使用中藥血清藥理學方法研究中藥復方的意義19
• 3.論文研究意義19-21
• 第二章 FTZ含藥血清的制備21-28
• 1.實驗材料和儀器21-22
• 1.1 藥品與試劑21-22
• 1.2 實驗儀器22
• 1.3 實驗動物22
• 2.實驗方法22-24
• 2.1 FTZ含藥血清與大鼠空白血清的制備22
• 2.2 血清及FTZ供試品的制備22-23
• 2.3 UPLC-MS檢測條件23-24
• 3.實驗結果24-27
• 3.1 大鼠空白血清與FTZ大鼠含藥血清的制備24
• 3.2 FTZ原藥及血清UPLC-ESI-MS圖譜24-27
• 4.本章小結27-28
• 第三章 FTZ含藥血清改善INS-1 胰島 β 細胞高糖引起氧化應激損傷的作用及機制探究28-47
• 1.實驗材料和儀器28-33
• 1.1 材料28-32
• 1.2 儀器設備32-33
• 2.實驗方法33-40
• 2.1 細胞培養(yǎng)33-34
• 2.2 細胞實驗34-40
• 3.數據分析40
• 4.實驗結果40-45
• 4.1 FTZ含藥血清對INS-1 胰島 β 細胞增殖活性的影響40-41
• 4.2 FTZ含藥血清對INS-1 胰島 β 細胞內ROS的影響41-43
• 4.3 FTZ含藥血清對INS-1 胰島 β 細胞內MDA的影響43
• 4.4 FTZ含藥血清對INS-1 細胞內抗氧化蛋白酶表達水平的影響43-45
• 5.本章小結45-47
• 第四章 FTZ含藥血清改善INS-1 胰島 β 細胞氧化應激引起的凋亡作用及機制探究47-62
• 1.實驗材料和儀器47-48
• 1.1 材料47-48
• 1.2 儀器設備48
• 2.實驗方法48-53
• 2.1 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測INS-1 細胞凋亡率48-49
• 2.2 檢測INS-1 細胞的caspase9活性49-51
• 2.3 檢測INS-1 細胞caspase3活性51-53
• 2.4 Western blot檢測目的蛋白表達量53
• 3.數據分析53
• 4.實驗結果53-61
• 4.1 FTZ含藥血清對氧化應激的INS-1 細胞凋亡的影響53-56
• 4.2 FTZ含藥血清對氧化應激的INS-1 細胞內caspase 9 活性的影響56
• 4.3 FTZ含藥血清對氧化應激的INS-1 細胞內caspase 3 活性的影響56-57
• 4.4 FTZ含藥血清對氧化應激的INS-1 細胞內Bcl-2 家族相關蛋白蛋表達的影響57-61
• 5.本章小結61-62
• 第五章 FTZ含藥血清改善INS-1 胰島 β 細胞葡萄糖刺激胰島素釋放作用及機制探究62-69
• 1.實驗材料和儀器62-63
• 1.1 材料62-63
• 1.2 儀器設備63
• 2.實驗方法63-65
• 2.1 Western blot檢測目的蛋白表達量63
• 2.2 INS-1 胰島 β 細胞分泌胰島素的檢測63-65
• 3.數據分析65
• 4.實驗結果65-68
• 4.1 FTZ含藥血清對氧化應激的INS-1 細胞內PDX-1 蛋白表達水平的影響65-66
• 4.2 FTZ含藥血清對氧化應激的INS-1 細胞內Glut2蛋白表達水平的影響66-67
• 4.3 FTZ含藥血清對INS-1 細胞葡萄糖刺激的胰島素釋放的影響67-68
• 5.本章小結68-69
• 第六章 結論與展望69-71
• 參考文獻71-80
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文80-81
• 英文簡略表81-84
• 致謝84-85

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