發(fā)布時間：2017-07-18 05:24

  本文關(guān)鍵詞：骨質(zhì)疏松癥脂肪干細(xì)胞Wnt信號通路相關(guān)差異基因篩選的實(shí)驗研究

  更多相關(guān)文章： Wnt信號通路 DKK-1 LiCl 骨質(zhì)疏松脂肪干細(xì)胞

【摘要】：第一部分:骨質(zhì)疏松小鼠模型建立及骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定目的:骨質(zhì)疏松病(Osteoporosis)的發(fā)病機(jī)制在于骨重建過程中成骨活動下降,破骨活動上升,導(dǎo)致骨代謝平衡被破壞,骨組織吸收大于形成。最終導(dǎo)致密質(zhì)骨變薄,骨小梁密度減低,骨質(zhì)疏松,骨折發(fā)生幾率增加,骨愈合能力降低[1]。脂肪干細(xì)胞來源豐富,易于獲取,以往對于脂肪干細(xì)胞的研究已證實(shí)該細(xì)胞具有骨向分化的潛能[2],而骨質(zhì)疏松脂肪干細(xì)胞是否具有同樣的成骨能力尚未見報道。本實(shí)驗通過建立小鼠骨質(zhì)疏松模型,分離培養(yǎng)建模成功的骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞(OP-ASCs)。為研究骨質(zhì)疏松癥脂肪干細(xì)胞Wnt信號通路相關(guān)差異基因篩選的實(shí)驗提供細(xì)胞支持。方法:(1)將雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗組(去勢組)和對照組(假手術(shù)組)。去勢組取10周齡小鼠(體重18~20克),切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后4 w、8w,從去勢組和假手術(shù)組隨機(jī)選取6只小鼠,麻醉后,采用micro-CT測定股骨中間骨干的骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction,BV/TV,%),通過對照上述指標(biāo)從影像學(xué)角度證明骨質(zhì)疏松小鼠造模成功。再從去勢組和假手術(shù)組中隨機(jī)選取6只小鼠,取其膝關(guān)節(jié)進(jìn)行切片及HE、MASSON染色,通過觀察其骨小梁密度、骨密質(zhì)厚度判斷造模成功與否。(2)頸椎脫法處死小鼠,75%酒精浸泡小鼠進(jìn)行全身消毒,取上述骨質(zhì)疏松小鼠腹股溝脂肪組織,使用組織塊法將小鼠脂肪組織剪碎,翻轉(zhuǎn)干涸,于含10%FBSα-MEM培養(yǎng)基中進(jìn)行小鼠OP-ASCs原代培養(yǎng),酶消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代,傳代至第二代時,得出所需骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞。(3)所得骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測,證明其干細(xì)胞特性。結(jié)果:從影像學(xué)及組織學(xué)方面證明去勢法構(gòu)建骨質(zhì)疏松小鼠模型成功,通過流式細(xì)胞學(xué)檢測骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其干細(xì)胞表面抗體為陽性,符合干細(xì)胞特性,證明組織塊法自骨質(zhì)疏松小鼠腹股溝脂肪取得的細(xì)胞確為骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞。結(jié)論:通過去勢法我們成功建立了骨質(zhì)疏松小鼠動物模型,自取得的骨質(zhì)疏松小鼠腹股溝取得OP-ASCs。第二部分骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞中Wnt信號通路的變化情況目的:以往研究證實(shí)Wnt信號通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、正常的脂肪干細(xì)胞的骨向分化中起著至關(guān)重要的作用[3-5],但在OP-ASCs中,Wnt信號通路是否與在其他種類的干細(xì)胞中一樣扮演著重要的角色,并且如果Wnt信號通路在OP-ASCs中同樣扮演著調(diào)控成骨的作用,其骨向分化的調(diào)控的具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研究目的在于通過上調(diào)及下調(diào)Wnt信號通路,篩選出Wnt信號通路中基因差異性表達(dá)出的關(guān)鍵因子,從而與現(xiàn)有研究的其他干細(xì)胞中的Wnt信號通路的關(guān)鍵因子變化進(jìn)行比較,并探究Wnt信號通路對OP-ASCs骨向分化的調(diào)控的具體分子機(jī)制,為骨質(zhì)疏松脂肪干細(xì)胞修復(fù)骨缺損等臨床應(yīng)用提供實(shí)驗依據(jù)。方法:將小鼠重組DKK-1蛋白按照0.1μg/ml加入含10%FBSα-MEM培養(yǎng)基,LiCl以50mg/ml加入含10%FBSα-MEM培養(yǎng)基,將骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞分為LiCl處理組、DKK-1處理組,并設(shè)置用10%FBSα-MEM培養(yǎng)基的對照組,在第一天、第三天兩個時間點(diǎn)提取細(xì)胞的總RNA,以Wnt信號通路PCR芯片結(jié)合Real-time PCR篩選出其中的Wnt信號通路有關(guān)的差異性基因。結(jié)果:第一天時,LiCl組小鼠OP-ASCs與對照組相比,Ccnd1基因表達(dá)上調(diào),Porcn、Sfrp 1、Sfrp 2、Sfrp 4、Wnt 5a基因表達(dá)降低,而DKK-1組小鼠OP-ASCs與對照組相比,Axin 1、Fzd 6、Wnt 5a基因表達(dá)上調(diào)。第三天時,LiCl組小鼠OP-ASCs與對照組相比,Wnt 2基因表達(dá)水平上調(diào),Nlk、Porcn、Wnt 5a基因表達(dá)水平下調(diào);DKK-1組小鼠OP-ASCs與對照組相比,Wif1、Wnt5a基因表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論:1.在OP-ASCs中,經(jīng)典Wnt信號通路同樣在調(diào)控這些基因的表達(dá),我們推測LiCl的加入上調(diào)了OP-ASCs中激活經(jīng)典Wnt信號通路的Wnt 2基因表達(dá),下調(diào)了抑制經(jīng)典Wnt信號通路的Porcn、Sfrp 1、Sfrp 2、Sfrp 4基因,激活了經(jīng)典Wnt信號通路,從而使其下游基因Ccnd1表達(dá)上調(diào);而DKK-1的加入上調(diào)了經(jīng)典Wnt信號通路抑制劑Axin 1、Wif1基因,從而抑制了經(jīng)典Wnt信號通路。2.LiCl的加入下調(diào)了非經(jīng)典Wnt信號通路的關(guān)鍵因子Wnt 5a、Nlk基因表達(dá),從而抑制了非經(jīng)典Wnt信號通路,而DKK-1的加入上調(diào)了非經(jīng)典Wnt信號通路的關(guān)鍵因子Wnt 5a、Fzd6基因表達(dá),從而激活了非經(jīng)典Wnt信號通路。
【關(guān)鍵詞】：Wnt信號通路 DKK-1 LiCl 骨質(zhì)疏松脂肪干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R580
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 前言12-16
• 第一部分 骨質(zhì)疏松小鼠模型建立及骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定16-30
• 材料與方法17-21
• 結(jié)果21-25
• 討論25-29
• 結(jié)論29-30
• 第二部分 PCR基因芯片檢測骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞中Wnt信號通路的變化情況30-49
• 材料及方法31-37
• 結(jié)果37-43
• 討論43-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 英漢縮略詞對照表55-56
• 致謝56-57
• PPARγ 和Wnt信號通路調(diào)節(jié)干細(xì)胞成骨或成脂分化（綜述）57-85
• 參考文獻(xiàn)69-85
• 附件85-88

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本文編號：556189