本文關(guān)鍵詞：抗卵泡刺激素受體（FSHR）納米抗體對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥作用效果的研究

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【摘要】：骨質(zhì)疏松(Osteoporosis)是指在骨形成過(guò)程中,破骨細(xì)胞增長(zhǎng)速率大于成骨細(xì)胞的增長(zhǎng)。卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)是垂體前葉嗜堿粒細(xì)胞分泌的一種激素,主要作用為促進(jìn)卵泡成熟,在絕經(jīng)前和絕經(jīng)后女性骨代謝調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。研究表明,FSH水平增高與性機(jī)能減退引起的骨質(zhì)疏松有密切關(guān)系,并且FSH對(duì)骨質(zhì)的作用不依賴于雌激素水平的變化,阻斷FSH的作用不僅能通過(guò)抑制骨的再吸收而顯著減少骨的流失,而且還能促進(jìn)骨的重建。在成年人和動(dòng)物中,FSHR主要表達(dá)在睪丸支持細(xì)胞和卵巢粒層細(xì)胞表面,FSHR也在成熟的人破骨細(xì)胞(OC)及破骨細(xì)胞前體即單核細(xì)胞表面表達(dá),成為阻斷FSH作用的潛在靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道,FSH與骨質(zhì)疏松(OP)具有密切聯(lián)系,在一定范圍內(nèi)阻斷FSH水平的升高在骨質(zhì)疏松癥的治療方面已經(jīng)取得了一定效果。納米抗體作為一種新型的單域抗體具有分子量小、穩(wěn)定性好、可溶性高,易與受體結(jié)合等優(yōu)勢(shì)從而發(fā)揮一定的生理功能。本研究的主要目的在于制備抗FSHR納米抗體,探討FSHR抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療效果,主要包括以下幾部分內(nèi)容:1、噬菌體展示技術(shù)從駱駝免疫抗體文庫(kù)中篩選抗FSHR納米抗體對(duì)FSHR免疫的駱駝VHH噬菌體展示文庫(kù)經(jīng)過(guò)3輪淘洗篩選,獲得了63個(gè)陽(yáng)性克隆,其中選擇豐度最高的2個(gè)克隆VHH-3F9與VHH-3F19,豐度較低的一個(gè)序列VHH-3F20以及單獨(dú)序列中隨機(jī)的2個(gè)VHH-3F8與VHH-3F10等5個(gè)VHH基因序列,將其構(gòu)建至pET22b載體,IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),Ni-離子親和色譜純化抗體蛋白,獲得了以上5個(gè)抗FSHR納米抗體。經(jīng)ELISA驗(yàn)證只有VHH-3F9與VHH-3F19能與FSHR結(jié)合,且VHH-3F9結(jié)合能力較高,另外4個(gè)納米抗體不結(jié)合。從而獲得了可以在上清和胞間質(zhì)均表達(dá)的抗FSHR納米抗體VHH-3F9,且濃度及純度較高。ELISA及Western Blot檢測(cè)該抗體能與FSHR特異性結(jié)合,且VHH-3F9納米抗體具有部分體外阻斷能力,測(cè)定其溫度穩(wěn)定性得知在37℃處理12 h仍保留70%的活性。2、制備抗FSHR駱駝多克隆抗體以原核表達(dá)純化的fshr234蛋白為抗原,對(duì)新疆雙峰駝進(jìn)行免疫,每隔兩周加強(qiáng)免疫,共免疫七次。在第七次加強(qiáng)免疫兩周后,對(duì)駱駝進(jìn)行免疫后采血,間接elisa法測(cè)定抗fshr多克隆抗體的血清效價(jià)達(dá)到128000大量收集駱駝免疫后血清,采用proteina柱子親和純化駱駝未免疫血清與免疫后血清,獲得抗fshr駱駝多克隆抗體總igg。elisa測(cè)得駱駝抗fshr多克隆抗體igg的最低反應(yīng)濃度為0.0625μg/ml。體外檢測(cè)抗fshr抗體與caov-3細(xì)胞表面fshr的結(jié)合,細(xì)胞免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明vhh-3f9納米抗體和抗fshr駱駝多克隆抗體igg與caov-3細(xì)胞表面的fshr均有結(jié)合,且多抗igg結(jié)合能力較高,vhh-3f9有部分結(jié)合能力。3、利用雙側(cè)卵巢切除建立sd大鼠骨質(zhì)疏松癥模型本研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物sd大鼠隨機(jī)分為兩組,分別是去勢(shì)ovx組和對(duì)照sham組。去勢(shì)后檢測(cè)雌二醇(e2)、卵泡刺激素(fsh)、黃體生成素(lh)等雌激素水平以及骨密度(bmd)以評(píng)價(jià)建立的骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)10周齡大鼠去勢(shì)2周后,與sham組相比,ovx組e2水平顯著下降(p0.01),且在2到5周內(nèi)保持平穩(wěn)狀態(tài)。fsh及l(fā)h水平均顯著增加(p0.05),且在2到5周內(nèi)增加趨勢(shì)緩慢,達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定水平。繼續(xù)飼養(yǎng)3周,即去勢(shì)8周后測(cè)定sd大鼠骨密度(bmd)水平,結(jié)果表明ovx組骨密度顯著低于sham組(p0.05),從而驗(yàn)證骨質(zhì)疏松癥模型成立。4、抗fshr抗體對(duì)sd大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療采用尾靜脈注射治療骨質(zhì)疏松癥sd大鼠,納米抗體vhh-3f9以及駱駝抗fshr多克隆抗體igg,按相同劑量即2mg/kg,亮丙瑞林(le)按1.6mg/kg,對(duì)照組注射200μl的pbs。各組每周均治療2次,共治療6周。采血進(jìn)行血清各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè),觀察每組對(duì)sd大鼠骨質(zhì)疏松癥的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照sham組相比,實(shí)驗(yàn)組e2水平均顯著降低(p0.05),而各組之間并無(wú)差異。隨著去勢(shì)后ovx組fsh水平的逐漸增加,vhh-3f9、igg注射骨質(zhì)疏松癥sd大鼠明顯抑制了fsh的增加,且igg效果強(qiáng)于vhh-3f9,但是差異并不顯著。ovx+le組,隨著注射le時(shí)間的延長(zhǎng),FSH水平顯著降低,發(fā)現(xiàn)LE的施加顯著抑制FSH(P0.05)。LH的變化與FSH趨勢(shì)一致,但OVX+VHH-3F9組LH水平高于OVX+IgG組。從而通過(guò)抑制FSH而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的。綜上所述,本研究在建立SD大鼠骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,通過(guò)從噬菌體免疫文庫(kù)中篩選得到親和力較高的抗FSHR納米抗體,免疫駱駝得到效價(jià)較高的抗FSHR多克隆抗體IgG,并用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療,以亮丙瑞林作為抑制FSH激素水平的對(duì)照,以確定抗FSHR抗體對(duì)于大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療效果。為將來(lái)進(jìn)一步預(yù)防骨質(zhì)疏松篩選有效藥物做一基礎(chǔ)研究,以便用于臨床診斷及骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防。
【關(guān)鍵詞】：卵泡刺激素 納米抗體 亮丙瑞林 骨質(zhì)疏松癥
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R580
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-10
• 英文縮略詞10-15
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述15-30
• 1 促性腺激素與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系15-18
• 1.1 卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）及其生理作用15
• 1.2 黃體生成素（Luteinizing Hormone，，LH）及其生理作用15-16
• 1.3 FSH與LH在卵泡成熟過(guò)程中存在的相互關(guān)系16
• 1.4 亮丙瑞林（LE）簡(jiǎn)介16-17
• 1.5 促性腺激素與骨質(zhì)疏松之間的關(guān)系17-18
• 2 納米抗體的研究概況18-20
• 2.1 納米抗體的簡(jiǎn)介18
• 2.2 納米抗體在研究領(lǐng)域的應(yīng)用18-20
• 3 骨質(zhì)疏松癥的治療20-23
• 3.1 骨質(zhì)疏松癥簡(jiǎn)介20-21
• 3.2 骨質(zhì)疏松癥研究進(jìn)展21
• 3.3 FSH對(duì)骨質(zhì)疏松癥的影響21-22
• 3.4 骨質(zhì)疏松癥的治療22-23
• 參考文獻(xiàn)23-30
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)研究30-76
• 第一章 利用噬菌體展示技術(shù)從駱駝抗體文庫(kù)中篩選抗FSHR納米抗體30-51
• 1 材料與方法31-36
• 1.1 材料31-33
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料31
• 1.1.2 試劑31
• 1.1.3 儀器31-32
• 1.1.4 培養(yǎng)基及溶液配制32-33
• 1.2 方法33-36
• 1.2.1 噬菌體的分離與擴(kuò)增33-34
• 1.2.2 抗FSHR納米抗體的親和篩選34
• 1.2.3 多克隆Phage ELISA34-35
• 1.2.4 原核表達(dá)載體pET22b-VHH-3F9的構(gòu)建35
• 1.2.5 VHH-3F9納米抗體的制備35
• 1.2.6 VHH-3F9納米抗體的結(jié)合活性檢測(cè)35-36
• 1.2.7 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)VHH-3F9的阻斷能力36
• 2 結(jié)果與分析36-46
• 2.1 抗原FSHR234蛋白的獲得36-37
• 2.2 FSHR234蛋白對(duì)噬菌體免疫文庫(kù)的篩選37-39
• 2.3 FSHR234抗原篩選獲得的VHH-X基因序列分析39-40
• 2.4 pMECS-VHH-X重組質(zhì)粒的提取及其酶切40-42
• 2.5 BL21-pET22b-VHH-3F8、3F10、3F9、3F19及 3F20轉(zhuǎn)化子的鑒定42
• 2.6 納米抗體VHH-3F9的誘導(dǎo)表達(dá)及其純化42-44
• 2.7 納米抗體VHH-3F9的結(jié)合活性檢測(cè)44-45
• 2.8 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)VHH-3F9的阻斷功能45-46
• 3 討論46-48
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 第二章 抗FSHR駱駝多克隆抗體的制備51-60
• 1 材料與方法52-54
• 1.1 材料52
• 1.2 方法52-54
• 1.2.1 FSHR234蛋白免疫新疆雙峰駝及其血清的采集52
• 1.2.2 駱駝來(lái)源抗FSHR多克隆抗體的純化52-53
• 1.2.3 間接ELISA法檢測(cè)抗FSHR多克隆抗體的最低結(jié)合濃度53
• 1.2.4 Western Blot檢測(cè)抗FSHR多克隆抗體結(jié)合特異性53
• 1.2.5 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)抗FSHR抗體在caov-3 細(xì)胞表面的結(jié)合53-54
• 2 結(jié)果54-58
• 2.1 駱駝來(lái)源抗FSHR多克隆抗體的純化54-56
• 2.2 抗FSHR多克隆抗體的最低結(jié)合濃度測(cè)定56
• 2.3 Western Blot檢測(cè)駱駝抗FSHR多克隆抗體結(jié)合特異性56
• 2.4 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)抗FSHR抗體在caov-3 細(xì)胞表面的結(jié)合56-58
• 3 討論58
• 參考文獻(xiàn)58-60
• 第三章 SD大鼠骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的建立60-68
• 1 材料與方法61-62
• 1.1 材料61
• 1.2 方法61-62
• 1.2.1 SD大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立61
• 1.2.2 大鼠血生化指標(biāo)及雌激素水平測(cè)定61
• 1.2.3 大鼠骨密度（BMD）測(cè)定61-62
• 1.2.4 數(shù)據(jù)處理及分析62
• 2 結(jié)果62-64
• 2.1 動(dòng)物生長(zhǎng)常規(guī)觀察62
• 2.2 大鼠血鈣（S-Ca）、血磷（S-P）含量測(cè)定62-63
• 2.3 大鼠血清E2、FSH、LH水平測(cè)定63-64
• 2.4 大鼠骨密度（BMD）檢測(cè)64
• 3 討論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 第四章 抗FSHR抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療68-76
• 1 材料69
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組69
• 1.2 試劑配置69
• 2 方法69-70
• 2.1 大鼠骨質(zhì)疏松模型的治療69
• 2.2 抗FSHR抗體治療SD大鼠雌激素及BMD檢測(cè)69-70
• 2.3 免疫組化觀察SD大鼠骨組織病理學(xué)變化70
• 3 結(jié)果70-73
• 3.1 治療過(guò)程中SD大鼠體重的變化70
• 3.2 抗體治療SD大鼠雌激素及BMD檢測(cè)70-72
• 3.3 抗體治療SD大鼠組織病理學(xué)觀察72-73
• 4 討論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-76
• 第三部分 結(jié)論與展望76-77
• 1 結(jié)論76
• 2 展望76-77
• 致謝77-79
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷79
• 參與課題79
• 發(fā)表文章79-80

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5 郭晶;湖羊FSHR和TGF-β1基因核心啟動(dòng)子區(qū)鑒定與表達(dá)調(diào)控[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 王亞男;京海黃雞FSHβ和FSHR基因的遺傳效應(yīng)及其表達(dá)規(guī)律研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

7 張瑞;揚(yáng)子鱷卵泡刺激素FSHβ及其受體FSHR的分子結(jié)構(gòu)及在雌性生殖周期中的時(shí)空表達(dá)變化[D];安徽師范大學(xué);2015年

8 龍威海;黔北麻羊繁殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平與多態(tài)性分析[D];貴州大學(xué);2015年

9 王文芳;高原甘加型藏羊發(fā)情周期卵巢FSHR和LHR分布及其mRNA表達(dá)規(guī)律研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

10 謝輝軍;FTO、TNF-α、FSHR基因多態(tài)與多囊卵巢綜合征易感性的相關(guān)性研究[D];南華大學(xué);2016年

本文編號(hào)：544983