目的:生長分化因子11(GDF11)作為一個新發(fā)現(xiàn)的生長分化因子,在胚胎發(fā)育以及抗衰老方面具有重要作用,但其對肥胖及肥胖相關(guān)性疾病的影響仍然未知。因此本研究通過構(gòu)建CHO細(xì)胞GDF11表達(dá)系統(tǒng),分離純化獲得GDF11蛋白,并進(jìn)一步探究了其對脂肪干細(xì)胞增殖分化以及脂肪代謝的影響,為GDF11在肥胖及肥胖相關(guān)性疾病中的潛在應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法:1、利用基因工程技術(shù)構(gòu)建pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR-GDF11質(zhì)粒。2、通過轉(zhuǎn)染構(gòu)建CHO細(xì)胞GDF11表達(dá)系統(tǒng),并通過鎳柱純化系統(tǒng)分離純化GDF11蛋白。3、利用CCK8法檢測GDF11對脂肪干細(xì)胞增殖的影響,利用油紅O染色和q-PCR檢測GDF11對脂肪干細(xì)胞成脂分化的影響。4、利用油紅O染色、甘油三酯檢測、甘油檢測等探究GDF11對脂肪代謝的影響。結(jié)果:1、通過菌落PCR、雙酶切和測序證明成功構(gòu)建了pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR-GDF11質(zhì)粒。2、通過SDS-PAGE電泳表明成功獲得了GDF11蛋白。3、GDF11能促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的增殖,并抑制其成脂分化。4、GDF11抑制脂肪細(xì)胞...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫詞
第一章 前言
    1 脂肪干細(xì)胞
    2 脂肪代謝
        2.1 ATGL：脂肪分解的初始步驟
        2.2 HSL：主要的DG脂肪酶
        2.3 MGL：脂肪分解的最后一步
        2.4 脂滴相關(guān)蛋白在脂解中的作用
    3 生長分化因子11(GDF11)
        3.1 GDF11的結(jié)構(gòu)
        3.2 GDF11的表達(dá)和分布
        3.3 GDF11的信號通路
        3.4 GDF11的功能
            3.4.1 GDF11在肌肉組織發(fā)育中的作用
            3.4.2 GDF11在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用
            3.4.3 GDF11在消化腺發(fā)育中的作用
            3.4.4 GDF11在泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育中的作用
            3.4.5 GDF11在骨骼發(fā)育中的作用
            3.4.6 GDF11在抗衰老與心血管疾病中的作用
    4 研究意義
    5 技術(shù)路線
第二章 GDF11的表達(dá)及純化
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)菌株、細(xì)胞與質(zhì)粒
        2.2 儀器與設(shè)備
        2.3 主要試劑
        2.4 本章所需核酸片段與引物序列
    3 主要試劑配方
    4 實(shí)驗(yàn)方法
        4.1 質(zhì)粒提取
        4.2 感受態(tài)細(xì)菌的制備及轉(zhuǎn)化
        4.3 PCR擴(kuò)增目的片段
        4.4 瓊脂糖核酸電泳
        4.5 膠回收
        4.6 目的片段和質(zhì)粒的雙酶切以及連接
        4.7 重組質(zhì)粒的鑒定
        4.8 CHO細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        4.9 轉(zhuǎn)染子鑒定
        4.10 GDF11蛋白的表達(dá)鑒定與純化
        4.11 GDF11活性鑒定
    5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.1 pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2 pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR-GDF11重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.3 轉(zhuǎn)染和篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子以及GDF11蛋白的表達(dá)純化
        5.4 GDF11蛋白活性鑒定
    6 討論
第三章 GDF11對脂肪干細(xì)胞增殖和成脂分化的影響
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 細(xì)胞
        2.2 儀器與設(shè)備
        2.3 主要試劑
        2.4 本章所涉及相關(guān)基因的引物
    3 主要試劑配方
    4 實(shí)驗(yàn)方法
        4.1 脂肪干細(xì)胞的分離提取
        4.2 脂肪干細(xì)胞鑒定
        4.3 細(xì)胞凍存
        4.4 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)
        4.5 細(xì)胞傳代或鋪板
        4.6 脂肪干細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
        4.7 脂肪干細(xì)胞周期檢測
        4.8 脂肪干細(xì)胞成脂分化
        4.9 油紅O染色
        4.10 茜素紅染色
        4.11 甲苯胺藍(lán)染色
        4.12 RNA提取與q-PCR
        4.13 細(xì)胞總蛋白質(zhì)的抽提
        4.14 蛋白質(zhì)濃度的測定及調(diào)整
        4.15 Westernblotting
        4.16 統(tǒng)計(jì)分析
    5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.1 脂肪干細(xì)胞的提取與鑒定
        5.2 GDF11對脂肪干細(xì)胞增殖的影響
        5.3 GDF11對脂肪干細(xì)胞中脂滴形成的影響
        5.4 GDF11對脂肪分化相關(guān)基因的影響
    6 討論
第四章 GDF11對脂肪代謝的影響
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 脂肪細(xì)胞
        2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.3 主要試劑
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 油紅O染色
        3.2 q-PCR
        3.3 Westernblotting
        3.4 甘油檢測
        3.5 甘油三酯檢測
        3.6 統(tǒng)計(jì)分析
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 脂肪細(xì)胞
        4.2 GDF11減少脂肪細(xì)胞中甘油三酯的積累并促進(jìn)脂肪分解
        4.3 GDF11對脂肪代謝相關(guān)基因或蛋白表達(dá)的影響
        4.4 GDF11通過PKA和BMP信號通路促進(jìn)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解代謝
    5 討論
第五章 結(jié)論及展望
參考文獻(xiàn)
附錄
碩士期間主要成果
致謝



本文編號：3782376