氟對(duì)牙齒和骨骼的生長發(fā)育至關(guān)重要,但是過量氟能造成牙齒、骨骼和其他組織的損傷,嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。研究表明,氟導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與自噬,然而它們之間的相互作用關(guān)系尚不明確。SIRT1,作為一種去乙酸化酶,能夠?qū)Χ喾N生理病理過程如細(xì)胞凋亡、增殖、自噬、代謝與細(xì)胞周期等進(jìn)行調(diào)控。因此,本文旨在以MC3T3-E1細(xì)胞為研究對(duì)象,探究細(xì)胞自噬和SIRT1在氟誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用,闡明SIRT1對(duì)細(xì)胞凋亡與自噬的調(diào)控機(jī)制。首先,采用不同濃度的氟化鈉處理MC3T3-E1細(xì)胞,建立氟誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡與自噬模型,使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化,AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡,PI單染檢測細(xì)胞周期,DCFH-DA探針檢測ROS,MDC染色觀察細(xì)胞自噬小體,RT-qPCR和Westernbloting檢測凋亡和自噬相關(guān)的蛋白水平。試驗(yàn)結(jié)果表明隨著氟濃度的增加細(xì)胞凋亡率增加;Caspase-3 mRNA的表達(dá)量上升。高濃度(1、2、3、4、5)×10-3mol/L的氟化鈉處理細(xì)胞后,細(xì)胞逐漸收縮和變圓,貼壁細(xì)胞逐漸減少;細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增高;細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2蛋白表...

【文章頁數(shù)】：101 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞對(duì)照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 氟中毒的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展
    1.2 氟中毒與骨損傷
    1.3 氟與骨細(xì)胞
    1.4 氟的作用過程
        1.4.1 細(xì)胞呼吸鏈
        1.4.2 細(xì)胞內(nèi)膜滲透性與膜電位
        1.4.3 ROS的產(chǎn)生
        1.4.4 細(xì)胞壞死
        1.4.5 凋亡
        1.4.6 分泌,運(yùn)輸與回收小泡
        1.4.7 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
        1.4.8 鈣與磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
        1.4.9 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)
        1.4.10 Na+/K+-ATPase
        1.4.11 囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白
        1.4.12 轉(zhuǎn)錄作用
        1.4.13 炎癥反應(yīng)
        1.4.14 細(xì)胞遷移
        1.4.15 細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期
    1.5 細(xì)胞凋亡與自噬的關(guān)系
        1.5.1 TOR激酶路徑在自噬與凋亡中的作用
        1.5.2 Beclin 1在自噬與凋亡中的作用
        1.5.3 Caspases對(duì)自噬的調(diào)控
        1.5.4 抗凋亡FLIPs對(duì)自噬的調(diào)控
        1.5.5 死亡相關(guān)蛋白激酶家族在凋亡與自噬中的作用
        1.5.6 p53在凋亡與自噬中的作用
    1.6 SIRT1在細(xì)胞凋亡與自噬中的作用
        1.6.1 Sirtuins的發(fā)現(xiàn)過程
        1.6.2 Sirtuins參與的生物學(xué)功能
        1.6.3 SIRT1的調(diào)節(jié)機(jī)制
    1.7 研究目的與意義
第二章 氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 細(xì)胞類型
        2.2.2 主要儀器和耗材
        2.2.3 主要試劑和試劑盒
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)所用溶液及其配制
    2.3 方法
        2.3.1 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3.2 細(xì)胞傳代
        2.3.3 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
        2.3.4 實(shí)驗(yàn)分組
        2.3.5 Annexin V-FITC/PI流式雙染色檢測氟誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡
        2.3.6 RT-qPCR檢測氟誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡
        2.3.7 Western bloting檢測氟誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡
        2.3.8 顯微鏡觀察高氟環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)變化的影響
        2.3.9 熒光顯微鏡檢測氟誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化
        2.3.10 PI流式染色檢測氟誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞周期變化
        2.3.11 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)
    2.4 結(jié)果
        2.4.1 氟化鈉對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響
        2.4.2 氟化鈉對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
        2.4.3 氟化鈉對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響
        2.4.5 氟化鈉對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響
        2.4.6 氟化鈉對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞周期的影響
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
第三章 氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 主要儀器與耗材
        3.2.2 主要試劑和試劑盒
        3.2.3 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.4 實(shí)驗(yàn)分組
        3.2.5 RT-qPCR檢測氟誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬
        3.2.6 Western bloting檢測氟誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬
        3.2.7 MDC法檢測氟誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬
        3.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 氟化鈉對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
        3.3.2 氟化鈉對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)自噬小體的影響
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 SIRT1在MC3T3-E1細(xì)胞凋亡與自噬中的作用
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 主要儀器與耗材
        4.2.2 主要試劑與試劑盒
        4.2.3 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.4 實(shí)驗(yàn)分組
        4.2.5 RT-qPCR檢測氟化鈉對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)SIRT1 mRNA表達(dá)變化的影響
        4.2.6 SIRT1激活物SRT1720與抑制物Ex-527對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞存活率的影響
        4.2.7 熒光顯微鏡檢測SIRT1對(duì)氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化的影響
        4.2.8 PI流式染色檢測氟誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞周期變化
        4.2.9 Annexin V-FITC/PI流式雙染色檢測SIRT1對(duì)氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響
        4.2.10 Western bloting檢測SIRT1對(duì)氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響
        4.2.11 MTT法檢測氟環(huán)境下SIRT1與自噬對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞存活率的影響
        4.2.12 顯微鏡觀察自噬對(duì)暴露于高氟環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)變化的影響
        4.2.13 RT-qPCR檢測SIRT1對(duì)氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬的影響
        4.2.14 Western bloting檢測SIRT1對(duì)氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬的影響
        4.2.15 熒光顯微鏡檢測SIRT1對(duì)氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬的影響
        4.2.16 激光共聚焦顯微鏡檢測SIRT1對(duì)氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬的影響
        4.2.17 Western bloting檢測氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬中SIRT1介導(dǎo)的細(xì)胞路徑
        4.2.18 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 氟化鈉對(duì)SIRT1的影響
        4.3.2 SIRIT1激活物SRT1720,抑制物Ex-527對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞存活率的影響
        4.3.3 SIRT1對(duì)氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響
        4.3.4 SIRT1對(duì)氟環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響
        4.3.5 氟環(huán)境下SIRT1對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞周期的影響
        4.3.6 SIRT1在氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡中介導(dǎo)的細(xì)胞路徑
        4.3.7 氟環(huán)境下SIRT1對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞存活率的影響
        4.3.8 自噬對(duì)暴露于氟環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞存活率的影響
        4.3.9 自噬對(duì)暴露于高氟環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)變化的影響
        4.3.10 SIRT1對(duì)氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬的影響
        4.3.11 SIRT1在氟化鈉誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬中介導(dǎo)的細(xì)胞路徑
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 研究展望
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡介



本文編號(hào)：3750482