氟對牙齒和骨骼的生長發(fā)育至關重要,但是過量氟能造成牙齒、骨骼和其他組織的損傷,嚴重威脅公共衛(wèi)生安全。研究表明,氟導致細胞凋亡與自噬,然而它們之間的相互作用關系尚不明確。SIRT1,作為一種去乙酸化酶,能夠對多種生理病理過程如細胞凋亡、增殖、自噬、代謝與細胞周期等進行調控。因此,本文旨在以MC3T3-E1細胞為研究對象,探究細胞自噬和SIRT1在氟誘導的細胞凋亡中的作用,闡明SIRT1對細胞凋亡與自噬的調控機制。首先,采用不同濃度的氟化鈉處理MC3T3-E1細胞,建立氟誘導的MC3T3-E1細胞凋亡與自噬模型,使用光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化,AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡,PI單染檢測細胞周期,DCFH-DA探針檢測ROS,MDC染色觀察細胞自噬小體,RT-qPCR和Westernbloting檢測凋亡和自噬相關的蛋白水平。試驗結果表明隨著氟濃度的增加細胞凋亡率增加;Caspase-3 mRNA的表達量上升。高濃度(1、2、3、4、5)×10-3mol/L的氟化鈉處理細胞后,細胞逐漸收縮和變圓,貼壁細胞逐漸減少;細胞內(nèi)ROS水平顯著增高;細胞內(nèi)Bax/Bcl-2蛋白表...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞對照表
第一章 文獻綜述
    1.1 氟中毒的研究現(xiàn)狀及進展
    1.2 氟中毒與骨損傷
    1.3 氟與骨細胞
    1.4 氟的作用過程
        1.4.1 細胞呼吸鏈
        1.4.2 細胞內(nèi)膜滲透性與膜電位
        1.4.3 ROS的產(chǎn)生
        1.4.4 細胞壞死
        1.4.5 凋亡
        1.4.6 分泌,運輸與回收小泡
        1.4.7 轉運蛋白
        1.4.8 鈣與磷酸轉運蛋白
        1.4.9 葡萄糖轉運
        1.4.10 Na+/K+-ATPase
        1.4.11 囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)蛋白
        1.4.12 轉錄作用
        1.4.13 炎癥反應
        1.4.14 細胞遷移
        1.4.15 細胞增殖與細胞周期
    1.5 細胞凋亡與自噬的關系
        1.5.1 TOR激酶路徑在自噬與凋亡中的作用
        1.5.2 Beclin 1在自噬與凋亡中的作用
        1.5.3 Caspases對自噬的調控
        1.5.4 抗凋亡FLIPs對自噬的調控
        1.5.5 死亡相關蛋白激酶家族在凋亡與自噬中的作用
        1.5.6 p53在凋亡與自噬中的作用
    1.6 SIRT1在細胞凋亡與自噬中的作用
        1.6.1 Sirtuins的發(fā)現(xiàn)過程
        1.6.2 Sirtuins參與的生物學功能
        1.6.3 SIRT1的調節(jié)機制
    1.7 研究目的與意義
第二章 氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞凋亡
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 細胞類型
        2.2.2 主要儀器和耗材
        2.2.3 主要試劑和試劑盒
        2.2.4 實驗所用溶液及其配制
    2.3 方法
        2.3.1 MC3T3-E1細胞培養(yǎng)
        2.3.2 細胞傳代
        2.3.3 細胞凍存與復蘇
        2.3.4 實驗分組
        2.3.5 Annexin V-FITC/PI流式雙染色檢測氟誘導的MC3T3-E1細胞凋亡
        2.3.6 RT-qPCR檢測氟誘導的MC3T3-E1細胞凋亡
        2.3.7 Western bloting檢測氟誘導的MC3T3-E1細胞凋亡
        2.3.8 顯微鏡觀察高氟環(huán)境下MC3T3-E1細胞形態(tài)變化的影響
        2.3.9 熒光顯微鏡檢測氟誘導的MC3T3-E1細胞內(nèi)ROS水平的變化
        2.3.10 PI流式染色檢測氟誘導的MC3T3-E1細胞周期變化
        2.3.11 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計
    2.4 結果
        2.4.1 氟化鈉對MC3T3-E1細胞凋亡的影響
        2.4.2 氟化鈉對MC3T3-E1細胞凋亡相關蛋白表達的影響
        2.4.3 氟化鈉對MC3T3-E1細胞形態(tài)學變化的影響
        2.4.5 氟化鈉對MC3T3-E1細胞內(nèi)ROS水平的影響
        2.4.6 氟化鈉對MC3T3-E1細胞周期的影響
    2.5 討論
    2.6 小結
第三章 氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞自噬
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 主要儀器與耗材
        3.2.2 主要試劑和試劑盒
        3.2.3 MC3T3-E1細胞培養(yǎng)
        3.2.4 實驗分組
        3.2.5 RT-qPCR檢測氟誘導的MC3T3-E1細胞自噬
        3.2.6 Western bloting檢測氟誘導的MC3T3-E1細胞自噬
        3.2.7 MDC法檢測氟誘導的MC3T3-E1細胞自噬
        3.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計
    3.3 結果
        3.3.1 氟化鈉對MC3T3-E1細胞自噬相關蛋白表達的影響
        3.3.2 氟化鈉對MC3T3-E1細胞內(nèi)自噬小體的影響
    3.4 討論
    3.5 小結
第四章 SIRT1在MC3T3-E1細胞凋亡與自噬中的作用
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 主要儀器與耗材
        4.2.2 主要試劑與試劑盒
        4.2.3 MC3T3-E1細胞培養(yǎng)
        4.2.4 實驗分組
        4.2.5 RT-qPCR檢測氟化鈉對MC3T3-E1細胞內(nèi)SIRT1 mRNA表達變化的影響
        4.2.6 SIRT1激活物SRT1720與抑制物Ex-527對MC3T3-E1細胞存活率的影響
        4.2.7 熒光顯微鏡檢測SIRT1對氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞內(nèi)ROS水平變化的影響
        4.2.8 PI流式染色檢測氟誘導的MC3T3-E1細胞周期變化
        4.2.9 Annexin V-FITC/PI流式雙染色檢測SIRT1對氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞凋亡的影響
        4.2.10 Western bloting檢測SIRT1對氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞凋亡的影響
        4.2.11 MTT法檢測氟環(huán)境下SIRT1與自噬對MC3T3-E1細胞存活率的影響
        4.2.12 顯微鏡觀察自噬對暴露于高氟環(huán)境下MC3T3-E1細胞形態(tài)變化的影響
        4.2.13 RT-qPCR檢測SIRT1對氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞自噬的影響
        4.2.14 Western bloting檢測SIRT1對氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞自噬的影響
        4.2.15 熒光顯微鏡檢測SIRT1對氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞自噬的影響
        4.2.16 激光共聚焦顯微鏡檢測SIRT1對氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞自噬的影響
        4.2.17 Western bloting檢測氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞自噬中SIRT1介導的細胞路徑
        4.2.18 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計
    4.3 結果
        4.3.1 氟化鈉對SIRT1的影響
        4.3.2 SIRIT1激活物SRT1720,抑制物Ex-527對MC3T3-E1細胞存活率的影響
        4.3.3 SIRT1對氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞凋亡的影響
        4.3.4 SIRT1對氟環(huán)境下MC3T3-E1細胞內(nèi)ROS水平的影響
        4.3.5 氟環(huán)境下SIRT1對MC3T3-E1細胞周期的影響
        4.3.6 SIRT1在氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞凋亡中介導的細胞路徑
        4.3.7 氟環(huán)境下SIRT1對MC3T3-E1細胞存活率的影響
        4.3.8 自噬對暴露于氟環(huán)境下MC3T3-E1細胞存活率的影響
        4.3.9 自噬對暴露于高氟環(huán)境下MC3T3-E1細胞形態(tài)變化的影響
        4.3.10 SIRT1對氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞自噬的影響
        4.3.11 SIRT1在氟化鈉誘導的MC3T3-E1細胞自噬中介導的細胞路徑
    4.4 討論
    4.5 小結
第五章 結論和創(chuàng)新點
    5.1 結論
    5.2 創(chuàng)新點
    5.3 研究展望
參考文獻
致謝
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本文編號：3750482