目的:氟是人體生長發(fā)育所必需的微量元素,適量的氟可以增強(qiáng)牙齒的抗齲能力,但機(jī)體長期攝入過量氟會引起地方性氟中毒。由于骨組織是氟主要的靶器官,因此過量氟引起的氟骨癥是最具代表性的,軟骨損傷是該癥的基本表現(xiàn)之一。軟骨形成過程受到全身激素、細(xì)胞因子和局部信號通路的共同調(diào)控。生物鐘是指生理學(xué)和行為的每日24小時節(jié)律,由外部時間線索產(chǎn)生的正、負(fù)反饋回路組成。正反饋回路由轉(zhuǎn)錄因子Clock和Bmal1組成,負(fù)反饋回路由轉(zhuǎn)錄因子Per和Cry組成。氟對軟骨形成過程增殖、分化的影響以及氟是否通過生物鐘信號通路調(diào)控軟骨形成過程尚未見報道。為此,我們通過大鼠孕哺期染毒的初斷乳仔鼠和小鼠ATDC5細(xì)胞,初步探索氟對ATDC5細(xì)胞體外分化過程的影響和生物鐘信號通路在其中發(fā)揮的作用。本研究擬為闡明氟抑制長骨生長的機(jī)制提供線索,為氟骨癥的防治提供理論依據(jù)。實驗方法:本研究選取孕哺期染毒的Wistar初斷乳仔鼠,通過免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠生長板軟骨中Bmal1蛋白的表達(dá)。本研究采用CCK8法確定氟抑制ATDC5細(xì)胞增殖的染毒劑量,在胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉誘導(dǎo)劑的作用下誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞分化,采用阿利新藍(lán)染色法... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

大鼠生長板軟骨細(xì)胞Bmal1蛋白的免疫組化染色（20X）

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文11圖2ATDC5細(xì)胞的CCK8細(xì)胞活力檢測及阿利新藍(lán)染色（A）用不同濃度的NaF處理ATDC5細(xì)胞72h，采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。（B）用含或不含10-3MNaF的分化培養(yǎng)液分別培養(yǎng)ATDC5細(xì)胞7、14和21天。采用阿利新藍(lán)染色法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白多糖的合成情況，并用體式顯微鏡對染色后細(xì)胞進(jìn)行拍照（2X）。（C）6M鹽酸胍裂解細(xì)胞并用酶標(biāo)儀檢測裂解液在650nm處的吸光度。實驗結(jié)果以X±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，n=3，比例尺為500μm。3.3.氟對小鼠ATDC5細(xì)胞分化標(biāo)志因子的影響3.3.1.氟對小鼠ATDC5細(xì)胞分化標(biāo)志因子mRNA的影響用含有ITS的分化培養(yǎng)液分別培養(yǎng)ATDC5細(xì)胞5、7、14和21天，采用實時熒光定量RCR法檢測ATDC5細(xì)胞分化標(biāo)志因子Sox9、Aggrecan、Col2a1、

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文14圖3ATDC5細(xì)胞各時點Sox9、Aggrecan、Col2a1、Ihh和Col10a1的mRNA和蛋白表達(dá)用含或不含10-3MNaF的分化培養(yǎng)液分別培養(yǎng)ATDC5細(xì)胞5、7、14和21天。（A）采用實時熒光定量PCR法檢測Sox9、Aggrecan、Col2a1、Ihh和Col10a1的mRNA表達(dá)。（B）采用免疫印跡法檢測Sox9、Col2a1、Ihh和Col10a1的蛋白表達(dá)。（C）以Gapdh為內(nèi)參，定量對照組和染氟組細(xì)胞的蛋白表達(dá)。實驗結(jié)果以X±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，n=3，比例尺為500μm。3.4.氟對小鼠ATDC5細(xì)胞內(nèi)CircadianClock信號通路的影響用含有ITS的分化培養(yǎng)液培養(yǎng)ATDC5細(xì)胞7天，采用實時熒光定量RCR法和免疫印跡法檢測ATDC5細(xì)胞生物鐘信號通路核心分子Bmal1、Clock、Per1和Cry1的mRNA和蛋白的表達(dá)。如圖4（A）所示，與對照組相比，染氟組Bmal1和Clock的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Cry1的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Per1的mRNA表達(dá)沒有變化。如圖4（B）和4（C）所示，與對照組相比，染氟組Bmal1和Clock的蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05)，Cry1和Per1的蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05)。圖4ATDC5細(xì)胞的Bmal1、Clock、Per1和Cry1的mRNA和蛋白表達(dá)用含或不含10-3MNaF的分化培養(yǎng)液培養(yǎng)ATDC5細(xì)胞7天。（A）采用實時熒光定量PCR

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]氟對體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響及SOD對氟的拮抗作用[J]. 于燕妮,蒙炳杰.  中國地方病學(xué)雜志. 2006(05)
[2]過量氟對實驗大鼠軟骨細(xì)胞分化及Ⅱ和Ⅹ型膠原表型表達(dá)的影響[J]. 許鵬,郭雄,姚建鋒,張富軍,耿冬,杜曉陽,蔡乾坤.  中華風(fēng)濕病學(xué)雜志. 2002(04)
[3]過量氟化物對軟骨損傷的研究進(jìn)展[J]. 許鵬,郭雄.  國外醫(yī)學(xué)(醫(yī)學(xué)地理分冊). 2001(01)

碩士論文
[1]Sedlin蛋白對人軟骨細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制[D]. 胡玉娟.重慶醫(yī)科大學(xué) 2014



本文編號：3479441