研究背景與目的:成人生長(zhǎng)激素缺乏癥是由垂體前葉分泌生長(zhǎng)激素不足引起的內(nèi)分泌疾病,常伴有身體成分組成比例改變,脂糖代謝紊亂,導(dǎo)致非酒精性脂肪肝發(fā)病率明顯高于正常人。我們既往研究表明,生長(zhǎng)激素缺乏條件下棕櫚酸（PA）可以加重肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積,本研究中,我們探討生長(zhǎng)激素缺乏狀態(tài)下棕櫚酸（PA）增加線粒體氧化應(yīng)激加重肝細(xì)胞凋亡的經(jīng)典信號(hào)通路。方法:構(gòu)建慢病毒干擾載體下調(diào)永生化肝L02細(xì)胞生長(zhǎng)激素受體（GHR）,PCR法檢測(cè)GHR的mRNA表達(dá)水平,構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)GHR的肝L02細(xì)胞株。用不同濃度PA（75umol,150umol或300umol）處理肝L02細(xì)胞12h,24h,48h,檢測(cè)細(xì)胞活力以篩選最適宜處理?xiàng)l件。將實(shí)驗(yàn)分為慢病毒GHR敲低組（shRNAGHR）和空載病毒（Vector）組,使用PA（150umol）干預(yù)細(xì)胞24h。采用油紅“O”,BODIPY熒光染色觀察生長(zhǎng)激素缺乏的L02肝細(xì)胞與對(duì)照肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;JC-1檢測(cè)L02肝細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化;DHE熒光探針檢測(cè)細(xì)胞ROS水平以及MitoSox熒光探針檢測(cè)線粒體ROS水平,western... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁(yè)數(shù)】：42 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PA對(duì)正常肝L02細(xì)胞活力的影響

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文16義鏈分別為:5’-TACAATAAGGTATCCAGATGG-3’。本研究驗(yàn)證該序列持續(xù)有效。如圖2所示，轉(zhuǎn)染慢病毒后用PCR技術(shù)檢測(cè)肝L02細(xì)胞GHR的mRNA水平，結(jié)果表明生長(zhǎng)激素受體基因敲低大于70%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示低表達(dá)生長(zhǎng)激素受體的肝細(xì)胞模型建立成功。圖2：重組慢病毒轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞抑制GHR表達(dá)Fig.2TheefficiencyofLenti-GHRvirustransfectedinL02cell.**meansP<0.012.3敲低GHR對(duì)凋亡及ROS的影響凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定出現(xiàn)的自發(fā)性的死亡過(guò)程，是一種主動(dòng)、高度有序、基因控制、信號(hào)依賴以及一系列酶參與的過(guò)程，在非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。氧化應(yīng)激反應(yīng)是ROS產(chǎn)生與清除的失調(diào)，在細(xì)胞內(nèi)堆積過(guò)多，活性氧自由基可以與多不飽和脂肪酸過(guò)氧化反應(yīng)生成過(guò)氧化脂質(zhì)，該過(guò)程會(huì)導(dǎo)致一系列毒性作用包括細(xì)胞內(nèi)蛋白以及酶變形，DNA氧化修飾，生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化，增加細(xì)胞對(duì)外界刺激的敏感性，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。為了探討敲低GHR對(duì)細(xì)胞ROS以及凋亡的影響，本研究采用150uMPA處理敲低GHR組與對(duì)照Vector組肝L02細(xì)胞，在12h，24h和48h檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平和ROS水平。本研究用annexvFITC-PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡，DHE熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。如圖3a提示GHR敲低組在12h，24h以及48h的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)目均高于對(duì)照組，圖3b提示GHR敲低組在12h，24h以及48h的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)ROS水平均高于正常對(duì)照組，圖3c為量化的細(xì)胞凋亡水平，圖3d量化的細(xì)胞ROS水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P<0.05,**P<0.01

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文182.4敲低GHR加重肝細(xì)胞脂肪沉積圖4油紅以及BODIPY觀察脂質(zhì)沉積情況Figure4EffectofknockdownGHRonleveloflipiddepositionlevelinPAhepatocyte脂質(zhì)沉積是細(xì)胞凋亡的重要因素，也是細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期特征。本研究通過(guò)油紅“O”以及BODIPY熒光染色檢測(cè)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況。將敲低組和Vector組細(xì)胞種于爬片，用150uM的PA干預(yù)細(xì)胞24小時(shí)。給予PA刺激后GHR敲低組與Vector組相比，肝細(xì)胞內(nèi)油紅顆粒聚集更加明顯，BODIPY胞質(zhì)內(nèi)熒光染色脂質(zhì)顆粒更豐富，提示PA干預(yù)敲低GHR的肝細(xì)胞更容易發(fā)生脂質(zhì)沉積。2.5敲低GHR對(duì)線粒體膜電位，線粒體內(nèi)ROS以及ATP的影響線粒體正常的膜電位維持了線粒體正常的功能，線粒體膜電位的去極化代表了線粒體凋亡的早期發(fā)生。為了觀察敲低GHR對(duì)線粒體凋亡以及線粒體ROS的影響，用150uM的PA干預(yù)細(xì)胞24小時(shí)，圖4a證實(shí)了敲低GHR的肝細(xì)胞給予PA刺激后JC-1染色復(fù)合體與單體紅綠光比率明顯下降，提示膜電位去極化損傷更加嚴(yán)重，是發(fā)生細(xì)胞凋亡早期特征；線粒體內(nèi)ROS是細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)品，過(guò)量的ROS產(chǎn)生直接會(huì)導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)功能的損傷，線粒體損傷會(huì)導(dǎo)致ROS消耗進(jìn)一步減少，ATP合成進(jìn)一步降低，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步損傷直至凋亡。圖4b使用特異性線粒體ROS檢測(cè)試劑mitoSox特異性熒光探針，表明與Vector組相比，敲低GHR組PA干預(yù)細(xì)胞后線粒體內(nèi)ROS明顯增加。使用ATP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒證實(shí)，敲低GHR組與Vector組相比，PA干預(yù)細(xì)胞后ATP水平明顯更低，證實(shí)了線粒體功能受損，利用ROS產(chǎn)生ATP的能力下降，細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除能力受損，如圖4c，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P<0.05,**p<0.01

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Nonalcoholic fatty liver disease and mitochondrial dysfunction[J]. R Scott Rector,John P Thyfault,Jamal A Ibdah.  World Journal of Gastroenterology. 2008(02)



本文編號(hào)：3458469