[目的]體外模擬一個高糖環(huán)境狀態(tài),觀察心臟成纖維細(xì)胞（Cardiac Fibroblasts CFs）在高糖環(huán)境下的生長情況,并進(jìn)一步探討高糖環(huán)境對CFs的影響、促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin EPO）對高糖環(huán)境誘導(dǎo)下體外培養(yǎng)乳鼠CFs的作用及RhoA/ROCK信號通路在其中的作用。在細(xì)胞水平為高糖促進(jìn)心肌纖維化提供進(jìn)一步的理論支持；進(jìn)一步研究在高糖環(huán)境下EPO對心臟重構(gòu)是否仍有保護(hù)作用及其中的具體機(jī)制；為糖尿病心肌病的防治提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。[方法]（1）CFs的培養(yǎng)：取出生1-3天的SD大鼠的心室肌,利用胰蛋白酶+Ⅱ型膠原酶雙酶消化法消化心肌組織,采用差速貼壁離心法分離,培養(yǎng)CFs并進(jìn)行傳代,使用生長良好的第2-3代細(xì)胞。（2）細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定細(xì)胞：選取生長良好的第2-3代CFs細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片,用PV通用型兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒鑒定CFs細(xì)胞。免疫組化結(jié)果：纖維連接蛋白（Fibronectin 1） （+）、波形蛋白（Vimentin） （+）、a-肌動蛋白（a-actin） （-）,證實(shí)為CFs細(xì)胞。（3）不同濃度葡萄糖對于CFs細(xì)胞增殖的影響：用不同濃度... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１々離培養(yǎng)ＣＦｓ（ｌＯＯＸ）??

合；繼續(xù)培養(yǎng)到７２ｈ，可見ＣＦｓ排列緊密，細(xì)胞可達(dá)８０％－９０％融合；繼續(xù)進(jìn)一??步培養(yǎng)，ＣＦｓ生長過密產(chǎn)生接觸抑制，有的細(xì)胞巧始出現(xiàn)調(diào)亡，在光鏡下可呈鋪??路石樣改變。如圖所示（圖１－１）。??１．２免疫化學(xué)染色鑒定細(xì)胞??采用ＰＶ二步法免疫組化檢測試劑鑒定ＣＦｓ，?ＣＦｓ的Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｌ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ??蛋白表達(dá)為陽性反應(yīng)（可見胞漿內(nèi)圍繞胞核的區(qū)域有棟褐色顆粒狀物質(zhì)生成）；??而必肌特異性ａ橫紋肌肌動蛋白（ａ－ａｃｔｉｎ）的表達(dá)為陰性（胞漿內(nèi)無蹤褐色顆粒??狀物質(zhì)形成）。由此鑒定該細(xì)胞為ＣＦｓ細(xì)胞，細(xì)胞純度可達(dá)９５％Ｗ上。如圖所示??調(diào)＾巧。??培養(yǎng)２４小時?培養(yǎng)４８小時?培養(yǎng)后７２小時??圖１－１々離培養(yǎng)ＣＦｓ（ｌＯＯＸ）??—３４—??

＊．心壑＇條始１！細(xì)＾＇、，?＊、纖：‘如誠興；Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（＋）?Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｌ（＋）?ａ－ａｃｔｉｎ?（－）??圖１－２細(xì)胞鑒定結(jié)果ＣＦｓ（１００５〇??二、ＣＣＫ－８檢測不同濃度葡萄糖對ＣＦｓ細(xì)胞增殖的影響??用ＣＣＫ－８檢測試劑來檢測培養(yǎng)基中不同摩爾濃度的葡萄糖對ＣＦｓ增巧響，分光光度計(jì)檢測出的吸光度值來反應(yīng)ＣＦｓ細(xì)胞的增巧情況，實(shí)驗(yàn)重遍，結(jié)果示：不同濃度（５．５ｍｍｏｌ／Ｌ，?ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ，?２５ｍｍｏｌ／Ｌ，?５０ｍｍｏｌ／Ｌ＜）葡刺激４８ｈ，可見各組隨著糖濃度的増加，對應(yīng)的吸光光度值也增加并且呈現(xiàn)量依賴性的關(guān)系；ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ組與對照組相比，對應(yīng)光度值呈上升趨勢，對應(yīng)的Ｐ值分別為：片８．０３Ｘ１０－７、Ｐ＝８．２４Ｘ１０－８、Ｐ＝１．９３Ｘ（戶＜０．０５），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；２５ｍｍｏｌ／Ｌ組達(dá)峰值，５０ｍｍｏｌ／Ｌ組晦有降但５０ｍｍｏｌ／Ｌ和２５ｍｍｏｌ／Ｌ組兩組相比，傳０．０５無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖所示調(diào)


本文編號：3122275