目的:建立SD大鼠海馬神經(jīng)元細胞原代培養(yǎng)模型,確定最適的高糖作用濃度和作用時間;檢測高糖作用下海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)ERK、p-ERK和MLCK的表達;探討高糖環(huán)境下海馬神經(jīng)元細胞MLCK與MAPK/ERK信號通路的相關(guān)性;初步研究高糖作用后二苯乙烯苷致MLCK表達下降的作用機制。方法:1.海馬神經(jīng)元細胞的原代培養(yǎng)及鑒定:以25mM為基礎(chǔ)糖濃度培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞,并用倒置顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài);細胞培養(yǎng)至第7天,通過NSE免疫組化染色鑒定海馬神經(jīng)元細胞的純度,并計算海馬神經(jīng)元細胞的純度;2.最適高糖濃度探索:原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞,將細胞懸液接種到96孔板中,細胞培養(yǎng)至第5天,將細胞分為25mM-24h組、25mM-48h組、25mM-72h組、45hmM-24h組、45mM-48h組、45mM-72h組;達到各組相應(yīng)的糖作用時間后,用CCK-8試劑盒檢測各組細胞的OD值,計算各組海馬神經(jīng)元的活性,得出最適高糖作用濃度。3.最適高糖作用時間的探索:原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞,將細胞懸液接種到玻底培養(yǎng)皿中,將細胞分為25mM組、45hmM-24h組、45mM-48h組、45mM-72h組;達到... 

【文章來源】：貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

剪開顱骨后的整個大腦

圖 1 剪開顱骨后的整個大腦 圖 2 暴露的海馬組織Fig.1 and 2 Sampling of hippocampal neurons1.2.3 海馬神經(jīng)元細胞的鑒定（NSE 染色法）（1）準備工作：細胞爬片的預(yù)處理：將細胞置于 24 孔板中，用 PBS 4 倍稀釋 10×PLL，取適量鋪滿培養(yǎng)板底部，置于細胞培養(yǎng)箱過夜后，PBS 漂洗 3 次，并放入培養(yǎng)箱晾干備用（所有操作均在超凈工作臺中）。（2）細胞培養(yǎng)方法同 2.2，直至制成細胞懸液。（3）免疫組化染色①將細胞懸液以5×105/mL 的密度接種到放置了細胞爬片的 24 孔培養(yǎng)板中；②細胞培養(yǎng)至第 7 天，從 24 孔板中取出爬片，37℃的 0.01M 的 PBS 浸洗 3次×2min；

個別細胞已開始長出突起，形態(tài)為圓形、橢圓形、錐體狀及不規(guī)則形；細胞胞體透亮、飽滿，立體感強，細胞周圍光暈明顯，折光性強；24h 后多數(shù)細胞長出長短不一的突起，可看到相鄰?fù)黄鹩猩倭窟B接（見圖 3-1）。（2）培養(yǎng) 3d 后，海馬神經(jīng)元細胞進一步生長，胞體增大，多為圓形、橢圓形或錐體形，以雙極和多極神經(jīng)元為主，表面光滑，折光性強，突起較之前明顯增長，局部有較多的突起相互連接成稀疏網(wǎng)絡(luò)（見圖 3-2）。（3）培養(yǎng) 5-7d 后，神經(jīng)元細胞形態(tài)成熟飽滿，體積較大，聚集生長更明顯，胞漿豐富，光暈明顯，發(fā)達的突起向外延伸并且變粗分出許多分支，互相連接形成密集交錯的網(wǎng)絡(luò)（見圖 3-3、圖 3-4）。（4）培養(yǎng) 11-13d 后，神經(jīng)細胞更加成熟，突起變得更加粗大，網(wǎng)絡(luò)更加致密。培養(yǎng)液內(nèi)出現(xiàn)懸浮的細胞碎片，一些神經(jīng)元細胞開始退化，細胞變形，突起開始斷裂變短，部分細胞裂解，細胞背景不干凈（見圖 3-5、圖 3-6）。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與糖尿病性認知功能障礙的研究進展[J]. 鄧成坤,張衛(wèi)權(quán),張霓,黃永杰,葉頻.  中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志. 2015(12)
[2]MAPK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖尿病腎病中的研究進展[J]. 劉沙,王建平.  世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘. 2015(62)
[3]何首烏有效成分二苯乙烯甙對神經(jīng)細胞保護作用機制研究[J]. 徐澤鶴,易佳佳.  亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥. 2013(07)
[4]何首烏的藥理作用、臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)[J]. 辛淑杰.  北方藥學(xué). 2013(07)
[5]高糖培養(yǎng)對乳鼠海馬神經(jīng)元存活及c-fos蛋白表達影響[J]. 凌俊輝,鐘珠,蔡斯俏,張鵬,林立國.  廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2013(03)
[6]二苯乙烯苷通過調(diào)節(jié)組蛋白去乙�；�1水平拮抗沙鼠腦缺血/再灌注損傷[J]. 陳曉宇,王棟,劉曉利,陳曉蓉,李俊.  解剖學(xué)報. 2013 (01)
[7]知母皂苷元對高糖引起的體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護作用[J]. 肖復(fù)茜,李洪秀,隋海娟,劉卓,屈文慧,郁盛雪,金迎新,金英.  中國藥理學(xué)通報. 2013(01)
[8]不同糖濃度中大鼠DRG神經(jīng)元相關(guān)蛋白表達及Ca2+濃度的測定[J]. 丁炎,那存烏力吉,閻雪晶,姚維凡,趙海山,陳磊.  中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2012(12)
[9]二苯乙烯苷對SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用[J]. 劉玲,賴術(shù),黎昀,黃忠仕.  中國現(xiàn)代中藥. 2012(10)
[10]糖尿病大鼠腦內(nèi)微血管細胞外信號調(diào)節(jié)激酶磷酸化的研究[J]. 黃艷,吳興臨,張建中,王巖.  寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2012(09)

碩士論文
[1]褪黑素通過ERK/MAPK通路調(diào)控動脈粥樣硬化模型兔動脈內(nèi)皮細胞MLCK的表達[D]. 程筱雯.安徽醫(yī)科大學(xué) 2007



本文編號：2900602