背景:糖尿病是心血管疾病加速發(fā)展的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素,也是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界亟需解決的科學(xué)難題。最新研究表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在糖尿病血管并發(fā)癥的形成中發(fā)揮了至關(guān)重要的調(diào)控作用。然而,尚不明確lncRNA在高血糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制。方法:在本課題組的前期研究中,通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)了多個(gè)在高糖刺激下表達(dá)上調(diào)的新lncRNA,我們選取有明顯差異性表達(dá)的lnc58(后稱HAVEN)深入分析其作用機(jī)制。通過構(gòu)建體外高糖刺激細(xì)胞模型,研究HAVEN及其鄰近基因的表達(dá)變化。構(gòu)建 1-磷酸鞘氨醇受體 1(Sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1PR1)、Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(Kruppel-like Factor 2,KLF2)質(zhì)粒,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot 檢測(cè)血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric-oxide synthase,eNOS)等基因的表達(dá)。利用小干擾RNA分別敲低人動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中KLF2和S1PR1的表達(dá),評(píng)價(jià)三者之間是否存在直接或間接作用。結(jié)果:前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HAVEN是高血糖誘導(dǎo)表達(dá)的新lncRNA。其鄰居基因S1PR1及其轉(zhuǎn)錄因子可參與HAVEN的表達(dá)調(diào)控,并通過調(diào)控內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)的表達(dá),參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。為研究其具體分子機(jī)制,我們構(gòu)建了體外細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)高糖刺激人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Aortic Endothelial Cells,HAEC)24小時(shí)后,HAVEN的表達(dá)有明顯上調(diào),而S1PR1、KLF2轉(zhuǎn)錄下調(diào)。構(gòu)建S1PR1、KLF2質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)在高血糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型中,分別過表達(dá)S1PR1或KLF2,均可逆轉(zhuǎn)高糖引起的HAEC中VCAM-1和eNOS的表達(dá)改變,并且過表達(dá)KLF2可上調(diào)S1PR1。利用小干擾RNA可分別敲低HAEC中KLF2和S1PR1的表達(dá),并且敲低KLF2不僅能下調(diào)S1PR1的表達(dá),還能下調(diào)HAVEN。但針對(duì)HAVEN三個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)不能有效敲低HAVEN。結(jié)論:本研究以此前期測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)一種新的lncRNA(HAVEN),HAVEN可通過與臨近基因S1PR1及其轉(zhuǎn)錄因子KLF2相互作用介導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng),為糖尿病血管并發(fā)癥提供了新的分子通路和干預(yù)靶標(biāo)。目的:采用數(shù)據(jù)挖掘方法,基于Matlab平臺(tái)對(duì)基因網(wǎng)絡(luò)擾動(dòng)可視化,以直觀顯示短時(shí)高血糖狀態(tài)下動(dòng)脈血管轉(zhuǎn)錄組改變。方法:在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究中心(NCB1)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載數(shù)據(jù)集。利用Matlab將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為計(jì)算機(jī)可識(shí)別的結(jié)構(gòu)體,經(jīng)過數(shù)據(jù)篩選,獲得短時(shí)高血糖后表達(dá)模式擾動(dòng)最明顯的基因譜。利用三種聚類算法分析,基于DAVID進(jìn)行基因本體學(xué)(gene ontology,GO)注釋及富集分析,把相關(guān)通路標(biāo)定在KEGG通路中,形成基因——表達(dá)譜系統(tǒng)分析。結(jié)果:經(jīng)過對(duì)數(shù)據(jù)集的篩選、聚類將基因的變化模式歸為9類,在該模型中有效地反應(yīng)出短時(shí)高血糖對(duì)動(dòng)脈血管的急性早期效應(yīng)。GO富集分析顯示,在急性炎癥反應(yīng)、心肌重構(gòu)、維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞趨化作用等方面的基因顯著富集;其中以與粘多糖、糖蛋白結(jié)構(gòu)相關(guān)基因、脂肪分解代謝、肌原纖維組裝相關(guān)基因顯著富集。這些發(fā)現(xiàn)與以往研究的結(jié)論相吻合。K-均值聚類方法顯示,在高血糖環(huán)境下基因表達(dá)上調(diào),且不隨血糖恢復(fù)正常表達(dá)的基因,主要有參與細(xì)胞周期調(diào)控、心肌重構(gòu)、維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的基因。結(jié)論:利用數(shù)據(jù)挖掘方法,實(shí)現(xiàn)急性高血糖對(duì)小鼠動(dòng)脈基因表達(dá)譜波動(dòng)模式的可視化描述,并為糖尿病的“代謝記憶”機(jī)制提供新的解釋,即早期的高糖效應(yīng)帶來的動(dòng)脈血管的不可逆的損傷,是導(dǎo)致冠心病患者降糖治療無(wú)效的原因。即短暫的高糖水平的暴露可在分子水平上起到長(zhǎng)久的影響。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，我們將?ｌｎｃＲＮＡ５８?命名為?Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ?Ｖａｓｃｕｌａｒ??Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ?ｃｅｌｌ?ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ?Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ?ＲＮＡ?（ＨＡＶＥＮ），并以?ＨＡＶＥＮ?及其鄰居基因??Ｓ１ＰＲ１為研宄的主要對(duì)象（圖１）。??ｈ?—?Ｈ??Ｓ１ＰＲ１?ＨＡＶＥＮ??Ｃｈｒｌ?—?????２４ｋｂ?＾??３０??１?ｉ?ＮＧ?，?．?ｔ?Ｉ??｜?ｅｘ：?〇????．?．?ｉ??ｉ?３０??ＨＧ??｜?．．?．???Ｉ??Ｉ?２６?Ｉ??１?＾?ＮＧ?１??？?Ｅ?｜?Ｉ??１?ｓ?？?．一?ｉ．?■??Ｉ?２?ＨＧ?｜?！??Ｉ．?１?Ｉ??圖１ＵＣＳＣ顯示ＨＡＶＥＮ和其上游基因Ｓ１ＰＲ１的相對(duì)位置及Ｈ３Ｋ４ｍｅ３分布??５．２高糖誘導(dǎo)ＨＡＶＥＮ及其臨近基因表達(dá)??為驗(yàn)證ＲＮＡ－ｓｅｑ所發(fā)現(xiàn)的ＨＡＶＥＮ是否真實(shí)存在，我們首先根據(jù)ＲＮＡ－ｓｅｑ預(yù)??測(cè)的ＨＡＶＥＮ的第一個(gè)外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)引物。構(gòu)建體外細(xì)胞模型，分別用普通濃度??（ｎｏｒｍａｌ?ｇｌｕｃｏｓｅ，ＮＧ，?５．６ｍＭ）和高糖（ｈｉｇｈ?ｇｌｕｃｏｓｅ，ＨＧ，２５ｍＭ）刺激人動(dòng)脈??１７??

內(nèi)皮細(xì)胞２４小時(shí)。隨后，我們用ｑＲＴ－ＰＣＲ分別檢測(cè)ＨＡＶＥＮ、Ｓ１ＰＲ１、ＫＬＦ２在??ＲＮＡ水平上的變化。結(jié)果顯示，ＨＡＶＥＮ在高糖刺激后表達(dá)明顯上調(diào)，而Ｓ１ＰＲ１??轉(zhuǎn)錄下調(diào)（圖２：?＊＊＊ｐ＜０．００１），與測(cè)序結(jié)果相一致。ＫＬＦ２是Ｓ１ＰＲ１的重要轉(zhuǎn)錄因??子，ｑＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果顯示ＫＬＦ２的表達(dá)也明顯下調(diào)（圖２：?＊＊＊ｐ＜０．００１）。因而我們??設(shè)想ＨＡＶＥＮ轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能受Ｓ１ＰＲ１的直接或間接調(diào)控。??｜１Ｓ１?■?ＮＧ?｜＇＊?ｆｌＮＧ?Ｊ９，?＿＿?■?ＮＣ??■?ＨＧ?？?■?ＨＧ?＜４－?■?ＨＧ??ｒ?■?ｒ?＿??ｄ?＿?ｉ］?ｍ?＾?ｊ?ｍ?Ｌｌｉ??Ｓ１ＰＲ１?ＫＬＦ２?ＨＡＶＥＮ??圖２高糖（ＨＧ）刺激下Ｓ１ＰＲ１、ＫＬＦ２、ＨＡＶＥＮ的表達(dá)水平??５．３?ＨＡＶＥＮ?具有?ｐｏｌｙＡ?尾??研究表明，約６０％成熟的非編碼ＲＮＡ?（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ｎｃＲＮＡ）有多聚腺??苷酸（ｐｏｌｙＡ）尾，以此維持ＲＮＡ結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。為了確定ＨＡＶＥＮ是否有ｐｏｌｙ尾修??飾，分別以和隨機(jī)六聚體（ｒａｎｄｏｍ?ｈｅｘａｍｅｒ）為逆轉(zhuǎn)錄（ｒｅｖｅｒｓ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，?ＲＴ）??引物，其中ｏｌｉｇｏ?ｄＴ只能與帶有ｐｏｌｙ?Ａ尾修飾的ＲＮＡ結(jié)合，ｒａｎｄｏｍｈｅｘａｍｅｒ可與??所有ＲＮＡ結(jié)合。因此，用ｏｌｉｇｏ?ｄＴ引物得到的ｃＤＮＡ庫(kù)，將只包含具有ｐｏｌｙ?Ａ尾??修飾的ＲＮＡ。既往研宄已證實(shí)

圖３?ＨＡＶＥＮ的ｐｏｌｙ?Ａ尾修飾??
【參考文獻(xiàn)】

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1 陳麗莉;范國(guó)洽;韓蕊;石志平;王濤;張潔;王雪;周亞茹;;二甲雙胍降低2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈磷酸化絲裂原活化蛋白激酶的蛋白表達(dá)[J];中國(guó)循環(huán)雜志;2015年05期

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本文編號(hào)：2891780