背景與目的肥胖是由多種因素引起的慢性代謝性疾病,�？蓪�(dǎo)致糖尿病,心臟病,血脂異常及高血壓等一系列并發(fā)癥。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)是一種來(lái)源于人羊膜,具有低免疫原性,高多向分化潛能、沒有致瘤作用的多功能干細(xì)胞。研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在抑制炎癥、組織修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值,但hAMSCs,特別是hAMSCs條件性培養(yǎng)基(Human amniotic mesenchymal stem cells conditional medium,hAMSCs-CM)對(duì)肥胖及其代謝病理進(jìn)程中的影響尚無(wú)明確報(bào)道。本課題旨在利用高脂飲食(High fat diet,HFD)誘導(dǎo)的小鼠肥胖模型,探討hAMSCs-CM對(duì)小鼠肥胖的影響,同時(shí)在體外細(xì)胞水平探討hAMSCs-CM對(duì)前體脂肪細(xì)胞3T3L1成熟分化以及巨噬細(xì)胞炎性分泌中的作用,最后結(jié)合蛋白芯片結(jié)果明確可能發(fā)揮作用的活性因子。本課題的完成將為深入挖掘hAMSCs-CM在肥胖防治中的應(yīng)用潛能提供新的思路。實(shí)驗(yàn)方法1.hAMSCs及其hAMSCs-CM的制備:取健康無(wú)致病菌產(chǎn)婦當(dāng)日羊膜,分別以胰酶及膠原酶消化得原代hAMSCs細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)5代以內(nèi)換無(wú)血清DMEM處理48小時(shí)濃縮備用,最后按照1.5×10~6細(xì)胞密度收集CM每20g小鼠進(jìn)行給藥。2.HFD誘導(dǎo)小鼠肥胖模型的建立:高脂飲食喂養(yǎng)小鼠15周建立肥胖模型,同時(shí)每周腹腔注射hAMSCs-CM一次,并通過(guò)檢測(cè)小鼠體重、組織形態(tài)染色、血脂及葡萄糖耐受等表型分析明確hAMSCs-CM對(duì)肥胖的影響。3.機(jī)制分析:1)利用油紅染色觀察hAMSCs-CM對(duì)前脂肪細(xì)胞3T3L1分化為成熟脂肪細(xì)胞的影響,并利用QPCR及Western blot法檢測(cè)脂質(zhì)合成相關(guān)基因蛋白PPARγ,SREBP1,FASN的表達(dá);2)利用QPCR法檢測(cè)hAMSCs-CM對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響,以LPS+IFN-γ處理RAW264.7巨噬細(xì)胞檢測(cè)M1型促進(jìn)炎癥相關(guān)蛋白基因的表達(dá),另以IL-4處理RAW264.7巨噬細(xì)胞檢測(cè)M2型抑制炎癥相關(guān)基因蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.hAMSCs-CM明顯改善HFD誘導(dǎo)的小鼠肥胖、脂肪肝,并可以降低HFD引起的高血脂、脂肪細(xì)胞肥大及葡萄糖耐受。2.hAMSCs-CM抑制前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的成熟分化:1)油紅染色結(jié)果顯示hAMSCs-CM可降低誘導(dǎo)分化引起的脂質(zhì)累積;2)QPCR及Western blot檢測(cè)顯示,hAMSCs-CM可顯著抑制脂質(zhì)合成相關(guān)基因蛋白PPARγ,SREBP1,FASN的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。3.hAMSCs-CM顯著抑制LPS+IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞M1型炎癥因子IL-6,IL-1β的轉(zhuǎn)錄以及促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)的M2型抗炎因子ARG-1,IL-10的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論hAMSCs-CM對(duì)HFD誘導(dǎo)的小鼠肥胖有顯著的抑制作用,其機(jī)制可能是通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞的成熟分化、進(jìn)而影響其脂質(zhì)累積及促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型向M2型的轉(zhuǎn)化而發(fā)揮作用。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R589.2
【部分圖文】：

14圖 2.1 高脂飲食（HFD）對(duì)小鼠各脂肪組織的影響。（A）高脂飲食 15 周后小鼠體重變化(g)；（B）15 周高脂后各組小鼠肝臟；HE 染色觀察各組小鼠肝臟形態(tài)（10×）；(C)肝臟組織甘油三酯（TG）含量檢測(cè)；（D-F）各組小鼠肝臟，腹部白色脂肪，腎臟周圍白色脂肪重量（g）；（G）各組小鼠腹部白色脂肪 HE 染色（10×）； （H）G 圖統(tǒng)計(jì)（n=3，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs HFD, #p<0.05,##p<0.01,###p<0.001vs CHOW-D）。

第 2 章 人羊膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件性培養(yǎng)基對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖的影響2.4.2 hAMSCs-CM 顯著改善對(duì)肥胖早期引起的葡萄糖耐受肥胖是由中樞神經(jīng)－內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)失調(diào)引起的代謝綜合癥，而葡萄糖耐受是其病理進(jìn)程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了研究 hAMSCs-CM 對(duì)葡萄糖耐量的影響，我們?cè)谖桂B(yǎng)的第 10 周及第 15 周進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)。禁食 16 小時(shí)后腹腔注射葡萄糖，結(jié)果顯示，第10周時(shí)HFD組葡萄糖注射后其血糖濃度顯著高于ND組，hAMSCs-CM 給藥可有效改善血糖的升高，這一現(xiàn)象說(shuō)明 hAMSCs-CM 能夠顯著改善 HFD 引起的葡萄糖耐受（圖 2.2 A）。但是到第 15 周 hAMSCs-CM 所表現(xiàn)出的改善作用完全消失，我們認(rèn)為其可能與模型后期小鼠體重快速累積，體重逐步超重有關(guān)（圖 2.2 B）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明 hAMSCs-CM 能夠在肥胖的早期顯著改善其葡萄糖耐受。

第 2 章 人羊膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件性培養(yǎng)基對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖的影響鼠的甘油三酯（TG），總膽固醇（TC），低密度脂蛋白（LDL）及高密度脂蛋白（HDL）均出現(xiàn)了明顯升高（圖 2.3 D.E.F.G），hAMSCs-CM 處理對(duì)其均有一個(gè)明顯改善作用。嚴(yán)重的肥胖也多伴有腎功能損傷。經(jīng)檢測(cè) 15 周的 HFD 喂養(yǎng)并未引起血肌酐（CREA）和尿素氮（BUN）的分泌異常，hAMSCs-CM 的處理也未發(fā)現(xiàn)對(duì)腎功能的影響（圖 2.3 H.I）。
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