TRPM2-GSK3β信號通路參與絕經(jīng)后糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的機制研究

發(fā)布時間：2020-11-12 18:55

　　研究背景:糖尿病性骨質(zhì)疏松(Diabetic Osteoporosis,DO)為世界性的健康問題,其發(fā)病機理尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase-3 beta,GSK3β)與糖尿病相關(guān),而TRPM2與胰島素代謝和鈣離子平衡都有密切關(guān)系,在TRPM2基因敲除的小鼠GSK-3β的活性發(fā)現(xiàn)了改變,提示TRPM2可能通過GSK3β信號通路影響成骨細胞/破骨細胞的增殖分化而改變骨骼的鈣平衡從而影響糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。本研究通過動物在體實驗來揭示TRPM2-GSK3β信號通路在該病中的作用機制,具有重要的臨床應(yīng)用前景。研究目的:本研究將通過對TRPM2-GSK3β通路調(diào)節(jié)的研究,來闡明DO的分子機制,研究成果將豐富和完善DO機制理論,為尋求臨床上治療該類疾病的新靶點提供理論依據(jù)和思路,為開發(fā)出相應(yīng)的藥物提供依據(jù),具有重要的科學價值和潛在的臨床應(yīng)用前景。研究方法:第一部分:從GEO數(shù)據(jù)庫下載已構(gòu)建的骨質(zhì)疏松癥血液樣本的mRNA表達譜芯片數(shù)據(jù)集,去除批間差后提取相關(guān)表達矩陣,初步驗證TRPM2、GSK3β的差異表達,并篩選差異表達基因(Differentially Expressed Genes,DEGs),利用DAVID對差異基因進行基因本體論(Gene Ontology,GO)及通路富集分析(KEGG),結(jié)果使用R包進行可視化。第二部分:24只3月齡雌性健康SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機分為正常對照組(Control組)、1型糖尿病(DM組)、單純?nèi)萁M(ED組)、去勢合并1型糖尿病組(ED+DM組),每組6只。ED組進行雙側(cè)卵巢切除法制作骨質(zhì)疏松大鼠模型,DM組采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射法制作糖尿病大鼠模型,ED+DM組進行手術(shù)摘除卵巢后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制作糖尿病性骨質(zhì)疏松模型。各組大鼠分別于12周末麻醉處死后取材,雙能X線吸收法(DXA)測定大鼠全身、腰椎及股骨骨密度(BMD),生物力學試驗評估腰椎、股骨骨強度,HE染色觀察骨組織形態(tài)學,免疫組化和ELISA法分別檢測股骨組織中及血清中TRPM2、GSK3β、p-GSK3β的表達。第三部分:24只3月齡清潔級雌性健康SD大鼠,隨機分為正常對照組(Control組)、糖尿病合并去勢組(ED+DM組)、TRPM2抑制劑+糖尿病合并去勢組(ED+DM+Clotrimazole組)、GSK-3β抑制劑組+糖尿病合并去勢組(ED+DM+AR-A014418組),每組6只。ED+DM組進行手術(shù)摘除卵巢后7天后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制作糖尿病性骨質(zhì)疏松模型;ED+DM+Clotrimazole組建立糖尿病合并去勢模型后腹腔注射TRPM2抑制劑克霉唑(Clotrimazole),每周2次;ED+DM+AR-A014418組建立糖尿病合并去勢模型后腹腔注射GSK3β抑制劑AR-A014418,每周2次。于12周末采用雙能X線吸收法(DXA)測定大鼠全身、腰椎、股骨骨密度(BMD),測量完麻醉處死取材;生物力學機檢測腰椎和股骨的彈性模量、彈性載荷、最大載荷、最大應(yīng)力等指標;HE染色觀察骨組織形態(tài)學改變;ELISA法檢測血清中TRPM2、GSK3β、p-GSK3β的表達;免疫組化法檢測股骨中TRPM2、GSK3β、p-GSK3β的表達。研究結(jié)果:第一部分:通過對兩個數(shù)據(jù)集去除批間差后提取表達矩陣后,驗證TRPM2、GSK3β的表達,結(jié)果顯示,TRPM2、GSK3β在骨質(zhì)疏松患者中表達增高;繼續(xù)分析差異基因共獲得948個DEGs,差異基因主要涉及翻譯起始的調(diào)節(jié)、中性粒細胞介導(dǎo)免疫、對細胞外刺激的反應(yīng)、中性粒細胞活化、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、翻譯起始、上皮細胞凋亡過程等生物過程,介導(dǎo)細胞粘附分子結(jié)合、鈣粘蛋白結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、翻譯因子活性、RNA結(jié)合、翻譯起始因子活性等分子功能,富集于細胞-基底結(jié);通路富集分析結(jié)果則顯示差異基因主要涉及cAMP信號通路、癌癥中的蛋白多糖、RNA轉(zhuǎn)運、破骨細胞分化、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、胰島素抵抗、胰高血糖素信號通路、HIF-1信號通路、醛固酮的合成和分泌等經(jīng)典信號通路。第二部分:骨密度(BMD)結(jié)果顯示,DM組、ED組和ED+DM組BMD均較Control組顯著降低(P0.05),其中ED+DM組下降最為明顯;生物力學結(jié)果同樣顯示,同Control組相比,ED組、DM組、ED+DM組的生物力學彈性模量等指標均下降(P0.05),其中ED+DM組最低;ELISA法測量血清中及免疫組化染色測量骨組織中TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表達量結(jié)果顯示,相比于Control組,DM組及ED+DM組TRPM2、p-GSK3β無論在骨組織還是血清中表達均上調(diào)(P0.05),其中ED+DM組表達最高,且顯著高于DM組(P0.05),ED組則表現(xiàn)為表達下調(diào)(P0.05),而GSK3β蛋白在各組的血清中表達無明顯的差異(P0.05),而在骨組織中表達則與p-GSK3β表達趨勢一致,ED組下調(diào),ED+DM組和DM組表達上調(diào),其中ED+DM組表達最高,且顯著高于DM組(P0.05)。第三部分:骨密度(BMD)結(jié)果顯示,第12周末時,ED+DM組較Control組BMD顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),ED+DM+Clotrimazole組、ED+DM+AR-A014418組較Control組BMD下降無統(tǒng)計學差異(P0.05);生物力學結(jié)果同樣顯示,同Control組相比,ED+DM組腰椎及股骨的生物力學指標,如彈性模量、彈性載荷、最大載荷、最大應(yīng)力等均下降,且具有統(tǒng)計學差異(P0.05);ED+DM+Clotrimazole組、ED+DM+AR-A014418組較Control組下降無統(tǒng)計學差異(P0.05);血清ELISA結(jié)果顯示,血清中TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表達量,與Control組相比,ED+DM組TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表達上調(diào)明顯,具有統(tǒng)計學意義(P0.05),ED+DM+Clotrimazole組TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表達量上調(diào)無統(tǒng)計學意義(P0.05),ED+DM+AR-A014418組GSK3β上調(diào)無統(tǒng)計學意義(P0.05),但TRPM2表達量上調(diào)仍明顯(P0.05)。而免疫組化結(jié)果卻顯示,與Control組相比,ED+DM組TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表達上調(diào)明顯,具有統(tǒng)計學意義(P0.05),ED+DM+Clotrimazole組TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表達量上調(diào)無統(tǒng)計學意義(P0.05),ED+DM+AR-A014418組GSK3β、p-GSK3β上調(diào)無統(tǒng)計學意義(P0.05),TRPM2表達量上調(diào)仍明顯(P0.05)。結(jié)論:單純?nèi)萁M大鼠的骨形態(tài)學變化主要表現(xiàn)為骨小梁數(shù)量的減少和缺失,而糖尿病組表現(xiàn)為骨小梁厚度明顯變細且多數(shù)斷裂,去勢合并糖尿病組則表現(xiàn)為骨小梁數(shù)量明顯減少,骨質(zhì)破壞及丟失程度最嚴重。而ED+DM+Clotrimazole組、ED+DM+AR-A014418組卻表現(xiàn)為骨小梁稍變細、無明顯斷裂。TRPM2、GSK3β、p-GSK3β在ED組、DM組和ED+DM組大鼠中表達均具有顯著差異,且TRPM2和GSK3β的抑制劑可以延緩糖尿病性骨質(zhì)疏松的進程進展,這提示TRPM2、GSK3β可能是糖尿病性骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵病理機制。TRPM2和GSK3β之間存在調(diào)控關(guān)系,糖尿病可能通過上調(diào)TRPM2,導(dǎo)致p-GSK3β上調(diào),GSK3β活性發(fā)生變化,進而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,TRPM2-GSK3β可能是導(dǎo)致糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵機制。
【學位單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R580
【部分圖文】：

樣本,處理結(jié)果,原始數(shù)據(jù),再用