目的:利用野生型p53誘導(dǎo)磷酸酶1(Wild type p53-induce phospatase 1,Wip1)基因敲除鼠,探討Wip1調(diào)控間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSC)治療小鼠1型糖尿病(TypeΙdiabetes,T1DM)的作用與機理,為闡明MSC治療T1DM的作用機制提供理論與實驗依據(jù)。方法:1.Wip1基因敲除鼠MSC的分離培養(yǎng)與鑒定。分離1周齡乳鼠,通過基因型鑒定確定Wip1敲除鼠,并分別培養(yǎng)正常MSC(Wip1~(+/+)MSC)與Wip1基因敲除的MSC(Wip1~(-/-)MSC)。采用Giemsa染色法觀察細胞形態(tài),流式細胞術(shù)鑒定細胞表型,體外分別進行成脂和成骨的誘導(dǎo)分化,并通過油紅O染色和堿性磷酸酶染色鑒定分化能力,同時采用實時熒光定量PCR(q-PCR)檢測成脂關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)、CCAAT增強子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancer binding protein alpha,CEBP/ɑ)及成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor,RunX2)、骨鈣素(Osteocalcin)的表達。2.Wip1調(diào)控MSC治療T1DM的療效觀察。利用鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)構(gòu)建小鼠T1DM模型,通過尾靜脈分別輸注5×10~5Wip1~(+/+)MSC或Wip1~(-/-)MSC觀察MSC治療T1DM的療效。實驗分為正常對照組、T1DM模型組、Wip1~(+/+)MSC治療組及Wip1~(-/-)MSC治療組。每周檢測小鼠一般生理狀態(tài)、血糖和體重變化;治療4周后采用HE染色和免疫組化法檢測各組小鼠胰腺組織病理改變及胰島素的分泌情況;酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測各組小鼠血清中炎癥因子IFN-γ、IL-4及IL-17a的表達,流式細胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟T淋巴細胞胞內(nèi)炎癥因子的表達。3.Wip1調(diào)控MSC治療T1DM的機制探討。利用Wip1~(+/+)MSC及Wip1~(-/-)MSC基因芯片結(jié)果結(jié)合生物信息學(xué)分析,篩選表達差異顯著且與免疫調(diào)控作用相關(guān)的靶基因BST2,采用q-PCR和Western blot法檢測Wip1~(-/-)MSC中BST2的表達;進一步構(gòu)建Wip1-EGFP過表達載體,轉(zhuǎn)染293T細胞,Western blot檢測Wip1與BST2的表達相關(guān)性;進而結(jié)合文獻檢索,獲得BST2的作用靶基因IFN-α,并采用q-PCR及ELISA法檢測Wip1~(-/-)MSC中IFN-α的表達;進一步,將人工合成的BST2 siRNA轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1~(-/-)MSC細胞,q-PCR檢測BST2與IFN-α的表達相關(guān)性。為證實Wip1在體內(nèi)是否通過BST2-IFN-α調(diào)控MSC免疫功能,我們首先采用免疫熒光法觀察Wip1~(+/+)和Wip1~(-/-)兩種MSC在胰腺組織中的歸巢情況,進一步利用ELISA法檢測各組小鼠胰腺及其周圍淋巴結(jié)(PLN)中相關(guān)炎癥因子IFN-α、TNF-α、IL-17a、IL-4和IL-10的表達,q-PCR法檢測各組小鼠脾臟淋巴細胞IFN-α、IFN-β及IFN-γ的表達。結(jié)果:1.通過鼠尾基因型檢測成功獲得Wip1~(-/-)小鼠,同時分離培養(yǎng)Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC,培養(yǎng)至P3代,經(jīng)Giemsa染色,倒置顯微鏡下觀察可見,兩種MSC細胞核均為橢圓形,均呈長梭形、旋渦狀貼壁生長;兩種MSC均高表達Sca-1、CD29、CD90,低表達CD34、CD45、CD11b和MHCII;兩種MSC經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化后,油紅染色均可見大量紅色脂滴,q-PCR檢測結(jié)果顯示,誘導(dǎo)組的PPAR-γ和CEBP/α表達均顯著上調(diào);成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果表明,誘導(dǎo)組細胞堿性磷酸酶活性增強,q-PCR檢測誘導(dǎo)組的RunX2及Osteocalcin表達亦顯著增加,上述結(jié)果提示,成功獲得Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC。2.為闡明Wip1~(-/-)MSC對小鼠T1DM的治療效果,我們首先建立了小鼠T1DM模型,進一步經(jīng)尾靜脈輸注Wip1~(+/+)MSC或Wip1~(-/-)MSC,結(jié)果表明,經(jīng)Wip1~(+/+)MSC治療后小鼠血糖逐漸下降,體重逐步回升;而Wip1~(-/-)MSC治療后血糖下降不明顯,體重上升不及Wip1~(+/+)MSC治療組。病理學(xué)檢測結(jié)果顯示,Wip1~(+/+)MSC治療組,胰島組織相對完整,胰島素分泌增加明顯;而Wip1~(-/-)MSC治療組胰島組織仍不完整,胰島素分泌亦不及Wip1~(+/+)MSC治療組明顯。流式細胞術(shù)及ELISA檢測結(jié)果表明,Wip1~(-/-)MSC治療組與Wip1~(+/+)MSC治療組相比較,脾臟淋巴細胞Th1細胞亞群IFN-γ的表達及血清中促炎因子IFN-γ及IL-17a的分泌均顯著上調(diào),而抗炎因子IL-4的分泌則顯著下調(diào)。3.為探討Wip1調(diào)控MSC治療小鼠T1DM的作用機制,我們首先通過Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC基因芯片的結(jié)果,篩選獲得差異顯著的BST2基因,進而采用q-PCR及Western blot證實Wip1~(-/-)MSC高表達BST2;通過構(gòu)建Wip1-EGFP過表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞實驗進一步證明Wip1調(diào)控BST2的表達。為明確BST2的作用靶基因為IFN-α,我們采用q-PCR和Western blot法檢測Wip1~(-/-)MSC是否表達IFN-α,結(jié)果顯示W(wǎng)ip1~(-/-)MSC亦高表達IFN-α。進而采用siRNA敲減Wip1~(-/-)MSC中BST2的表達,結(jié)果表明IFN-α的表達亦顯著下調(diào),上述結(jié)果提示W(wǎng)ip1通過調(diào)控BST2進而影響IFN-α的表達達到調(diào)控MSC免疫調(diào)節(jié)功能的目的。進一步小鼠體內(nèi)實驗檢測結(jié)果顯示,Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC均可歸巢至受損的胰腺組織進而發(fā)揮治療作用;ELISA檢測結(jié)果表明,Wip1~(-/-)MSC在PLN中同樣促進IFN-α的分泌,且上調(diào)促炎因子TNF-α和IL-17a的表達,下調(diào)抗炎因子IL-4、IL-10的表達。q-PCR檢測小鼠脾臟淋巴細胞IFN家族表達情況,結(jié)果顯示,Wip1~(-/-)MSC可使小鼠脾臟淋巴細胞中IFN-α、IFN-β及IFN-γ的表達顯著上調(diào)。結(jié)論:Wip1通過調(diào)控MSC中BST2-IFN-α的表達影響其免疫調(diào)節(jié)作用,為闡明MSC治療T1DM的作用機制提供了新的理論與實驗依據(jù)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

圖 1. 1 周齡乳鼠基因型鑒定結(jié)果1.2.2 Wip1+/+MSC 與 Wip1-/-MSC 的細胞形態(tài)提取小鼠骨片細胞，培養(yǎng) 3 天后，細胞換液，倒置顯微鏡下觀察可見Wip1+/+MSC 與 Wip1-/-MSC 分別從骨片中開始爬出，培養(yǎng)至第 3 天時，細胞呈集落樣聚集生長（圖 2A、圖 2D）；當細胞培養(yǎng)至第 3 代，待細胞長滿至 80%左右，在顯微鏡下觀察兩種 MSC 的形態(tài)，可見細胞呈長梭形貼壁生長(圖 2B、圖 2E)，經(jīng) Giemsa 染色后，可見細胞核呈橢圓形，細胞形態(tài)為成纖維狀，貼壁生長（圖2C、圖 2F）。

圖 1. 1 周齡乳鼠基因型鑒定結(jié)果1.2.2 Wip1+/+MSC 與 Wip1-/-MSC 的細胞形態(tài)提取小鼠骨片細胞，培養(yǎng) 3 天后，細胞換液，倒置顯微鏡下觀察可見Wip1+/+MSC 與 Wip1-/-MSC 分別從骨片中開始爬出，培養(yǎng)至第 3 天時，細胞呈集落樣聚集生長（圖 2A、圖 2D）；當細胞培養(yǎng)至第 3 代，待細胞長滿至 80%左右，在顯微鏡下觀察兩種 MSC 的形態(tài)，可見細胞呈長梭形貼壁生長(圖 2B、圖 2E)，經(jīng) Giemsa 染色后，可見細胞核呈橢圓形，細胞形態(tài)為成纖維狀，貼壁生長（圖2C、圖 2F）。

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文圖 3. Wip1+/+MSC 和 Wip1-/-MSC 細胞流式鑒定結(jié)果A.Wip1+/+MSC 表面抗原表達情況B.Wip1-/-MSC 表面抗原表達情況1.2.4 Wip1+/+MSC 與 Wip1-/-MSC 的成脂誘導(dǎo)分化Wip1+/+MSC 和 Wip1-/-MSC 經(jīng)成脂誘導(dǎo) 8 天，經(jīng)油紅 O 染色，倒置顯微鏡下觀察，可見兩種 MSC 自分化組基本看不到脂滴的存在（圖 4A、圖 4D），而誘導(dǎo)組可見大量的紅色脂滴（圖 4B、圖 4E）。為進一步證實誘導(dǎo)組具有成脂能力，利用 q-PCR 檢測成脂關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子 PPAR-γ 和 CEBP/α 的表達，結(jié)果表明，兩種 MSC 誘導(dǎo)組 PPAR-γ 和 CEBP/α 的表達均顯著高于自分化組（圖 4C、圖 4F）。
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本文編號：2877508