目的:利用野生型p53誘導(dǎo)磷酸酶1(Wild type p53-induce phospatase 1,Wip1)基因敲除鼠,探討Wip1調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSC)治療小鼠1型糖尿病(TypeΙdiabetes,T1DM)的作用與機(jī)理,為闡明MSC治療T1DM的作用機(jī)制提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.Wip1基因敲除鼠MSC的分離培養(yǎng)與鑒定。分離1周齡乳鼠,通過基因型鑒定確定Wip1敲除鼠,并分別培養(yǎng)正常MSC(Wip1~(+/+)MSC)與Wip1基因敲除的MSC(Wip1~(-/-)MSC)。采用Giemsa染色法觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表型,體外分別進(jìn)行成脂和成骨的誘導(dǎo)分化,并通過油紅O染色和堿性磷酸酶染色鑒定分化能力,同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)檢測(cè)成脂關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancer binding protein alpha,CEBP/ɑ)及成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor,RunX2)、骨鈣素(Osteocalcin)的表達(dá)。2.Wip1調(diào)控MSC治療T1DM的療效觀察。利用鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)構(gòu)建小鼠T1DM模型,通過尾靜脈分別輸注5×10~5Wip1~(+/+)MSC或Wip1~(-/-)MSC觀察MSC治療T1DM的療效。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、T1DM模型組、Wip1~(+/+)MSC治療組及Wip1~(-/-)MSC治療組。每周檢測(cè)小鼠一般生理狀態(tài)、血糖和體重變化;治療4周后采用HE染色和免疫組化法檢測(cè)各組小鼠胰腺組織病理改變及胰島素的分泌情況;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)各組小鼠血清中炎癥因子IFN-γ、IL-4及IL-17a的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)。3.Wip1調(diào)控MSC治療T1DM的機(jī)制探討。利用Wip1~(+/+)MSC及Wip1~(-/-)MSC基因芯片結(jié)果結(jié)合生物信息學(xué)分析,篩選表達(dá)差異顯著且與免疫調(diào)控作用相關(guān)的靶基因BST2,采用q-PCR和Western blot法檢測(cè)Wip1~(-/-)MSC中BST2的表達(dá);進(jìn)一步構(gòu)建Wip1-EGFP過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,Western blot檢測(cè)Wip1與BST2的表達(dá)相關(guān)性;進(jìn)而結(jié)合文獻(xiàn)檢索,獲得BST2的作用靶基因IFN-α,并采用q-PCR及ELISA法檢測(cè)Wip1~(-/-)MSC中IFN-α的表達(dá);進(jìn)一步,將人工合成的BST2 siRNA轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1~(-/-)MSC細(xì)胞,q-PCR檢測(cè)BST2與IFN-α的表達(dá)相關(guān)性。為證實(shí)Wip1在體內(nèi)是否通過BST2-IFN-α調(diào)控MSC免疫功能,我們首先采用免疫熒光法觀察Wip1~(+/+)和Wip1~(-/-)兩種MSC在胰腺組織中的歸巢情況,進(jìn)一步利用ELISA法檢測(cè)各組小鼠胰腺及其周圍淋巴結(jié)(PLN)中相關(guān)炎癥因子IFN-α、TNF-α、IL-17a、IL-4和IL-10的表達(dá),q-PCR法檢測(cè)各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞IFN-α、IFN-β及IFN-γ的表達(dá)。結(jié)果:1.通過鼠尾基因型檢測(cè)成功獲得Wip1~(-/-)小鼠,同時(shí)分離培養(yǎng)Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC,培養(yǎng)至P3代,經(jīng)Giemsa染色,倒置顯微鏡下觀察可見,兩種MSC細(xì)胞核均為橢圓形,均呈長(zhǎng)梭形、旋渦狀貼壁生長(zhǎng);兩種MSC均高表達(dá)Sca-1、CD29、CD90,低表達(dá)CD34、CD45、CD11b和MHCII;兩種MSC經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化后,油紅染色均可見大量紅色脂滴,q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)組的PPAR-γ和CEBP/α表達(dá)均顯著上調(diào);成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果表明,誘導(dǎo)組細(xì)胞堿性磷酸酶活性增強(qiáng),q-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)組的RunX2及Osteocalcin表達(dá)亦顯著增加,上述結(jié)果提示,成功獲得Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC。2.為闡明Wip1~(-/-)MSC對(duì)小鼠T1DM的治療效果,我們首先建立了小鼠T1DM模型,進(jìn)一步經(jīng)尾靜脈輸注Wip1~(+/+)MSC或Wip1~(-/-)MSC,結(jié)果表明,經(jīng)Wip1~(+/+)MSC治療后小鼠血糖逐漸下降,體重逐步回升;而Wip1~(-/-)MSC治療后血糖下降不明顯,體重上升不及Wip1~(+/+)MSC治療組。病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,Wip1~(+/+)MSC治療組,胰島組織相對(duì)完整,胰島素分泌增加明顯;而Wip1~(-/-)MSC治療組胰島組織仍不完整,胰島素分泌亦不及Wip1~(+/+)MSC治療組明顯。流式細(xì)胞術(shù)及ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,Wip1~(-/-)MSC治療組與Wip1~(+/+)MSC治療組相比較,脾臟淋巴細(xì)胞Th1細(xì)胞亞群IFN-γ的表達(dá)及血清中促炎因子IFN-γ及IL-17a的分泌均顯著上調(diào),而抗炎因子IL-4的分泌則顯著下調(diào)。3.為探討Wip1調(diào)控MSC治療小鼠T1DM的作用機(jī)制,我們首先通過Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC基因芯片的結(jié)果,篩選獲得差異顯著的BST2基因,進(jìn)而采用q-PCR及Western blot證實(shí)Wip1~(-/-)MSC高表達(dá)BST2;通過構(gòu)建Wip1-EGFP過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明Wip1調(diào)控BST2的表達(dá)。為明確BST2的作用靶基因?yàn)镮FN-α,我們采用q-PCR和Western blot法檢測(cè)Wip1~(-/-)MSC是否表達(dá)IFN-α,結(jié)果顯示W(wǎng)ip1~(-/-)MSC亦高表達(dá)IFN-α。進(jìn)而采用siRNA敲減Wip1~(-/-)MSC中BST2的表達(dá),結(jié)果表明IFN-α的表達(dá)亦顯著下調(diào),上述結(jié)果提示W(wǎng)ip1通過調(diào)控BST2進(jìn)而影響IFN-α的表達(dá)達(dá)到調(diào)控MSC免疫調(diào)節(jié)功能的目的。進(jìn)一步小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC均可歸巢至受損的胰腺組織進(jìn)而發(fā)揮治療作用;ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,Wip1~(-/-)MSC在PLN中同樣促進(jìn)IFN-α的分泌,且上調(diào)促炎因子TNF-α和IL-17a的表達(dá),下調(diào)抗炎因子IL-4、IL-10的表達(dá)。q-PCR檢測(cè)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞IFN家族表達(dá)情況,結(jié)果顯示,Wip1~(-/-)MSC可使小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中IFN-α、IFN-β及IFN-γ的表達(dá)顯著上調(diào)。結(jié)論:Wip1通過調(diào)控MSC中BST2-IFN-α的表達(dá)影響其免疫調(diào)節(jié)作用,為闡明MSC治療T1DM的作用機(jī)制提供了新的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

圖 1. 1 周齡乳鼠基因型鑒定結(jié)果1.2.2 Wip1+/+MSC 與 Wip1-/-MSC 的細(xì)胞形態(tài)提取小鼠骨片細(xì)胞，培養(yǎng) 3 天后，細(xì)胞換液，倒置顯微鏡下觀察可見Wip1+/+MSC 與 Wip1-/-MSC 分別從骨片中開始爬出，培養(yǎng)至第 3 天時(shí)，細(xì)胞呈集落樣聚集生長(zhǎng)（圖 2A、圖 2D）；當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第 3 代，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至 80%左右，在顯微鏡下觀察兩種 MSC 的形態(tài)，可見細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)(圖 2B、圖 2E)，經(jīng) Giemsa 染色后，可見細(xì)胞核呈橢圓形，細(xì)胞形態(tài)為成纖維狀，貼壁生長(zhǎng)（圖2C、圖 2F）。

圖 1. 1 周齡乳鼠基因型鑒定結(jié)果1.2.2 Wip1+/+MSC 與 Wip1-/-MSC 的細(xì)胞形態(tài)提取小鼠骨片細(xì)胞，培養(yǎng) 3 天后，細(xì)胞換液，倒置顯微鏡下觀察可見Wip1+/+MSC 與 Wip1-/-MSC 分別從骨片中開始爬出，培養(yǎng)至第 3 天時(shí)，細(xì)胞呈集落樣聚集生長(zhǎng)（圖 2A、圖 2D）；當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第 3 代，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至 80%左右，在顯微鏡下觀察兩種 MSC 的形態(tài)，可見細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)(圖 2B、圖 2E)，經(jīng) Giemsa 染色后，可見細(xì)胞核呈橢圓形，細(xì)胞形態(tài)為成纖維狀，貼壁生長(zhǎng)（圖2C、圖 2F）。

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文圖 3. Wip1+/+MSC 和 Wip1-/-MSC 細(xì)胞流式鑒定結(jié)果A.Wip1+/+MSC 表面抗原表達(dá)情況B.Wip1-/-MSC 表面抗原表達(dá)情況1.2.4 Wip1+/+MSC 與 Wip1-/-MSC 的成脂誘導(dǎo)分化Wip1+/+MSC 和 Wip1-/-MSC 經(jīng)成脂誘導(dǎo) 8 天，經(jīng)油紅 O 染色，倒置顯微鏡下觀察，可見兩種 MSC 自分化組基本看不到脂滴的存在（圖 4A、圖 4D），而誘導(dǎo)組可見大量的紅色脂滴（圖 4B、圖 4E）。為進(jìn)一步證實(shí)誘導(dǎo)組具有成脂能力，利用 q-PCR 檢測(cè)成脂關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子 PPAR-γ 和 CEBP/α 的表達(dá)，結(jié)果表明，兩種 MSC 誘導(dǎo)組 PPAR-γ 和 CEBP/α 的表達(dá)均顯著高于自分化組（圖 4C、圖 4F）。
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本文編號(hào)：2877508