研究背景：糖尿病腎病(DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥,目前仍以較晚期的降壓、降糖治療為主,缺乏針對(duì)其早期發(fā)病機(jī)制的深入研究及干預(yù)措施。目前針對(duì)糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在多元醇及蛋白激酶C通路激活,糖基化終末產(chǎn)物累積以及炎癥信號(hào)通路活化等方面。而這些因素與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)密不可分。但目前關(guān)于IR在糖尿病腎病中的具體表現(xiàn)形式及針對(duì)IR干預(yù)措施的研究相對(duì)較少。AS160是一種Rab-GTP酶活化蛋白,可以調(diào)控包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體在內(nèi)的多種物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)位過程。在腎臟,AS160被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控鈉、水通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn),但對(duì)于腎臟糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控未見報(bào)道。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)是介導(dǎo)胰島素刺激的糖攝取的主要糖轉(zhuǎn)運(yùn)體,是胰島素信號(hào)通路的重要效應(yīng)器,與IR密切相關(guān)。在經(jīng)典胰島素敏感組織如骨骼肌和脂肪細(xì)胞中,AS160被發(fā)現(xiàn)是糖代謝胰島素信號(hào)通路中GLUT4的上游分子,其磷酸化形式可促進(jìn)GLUT4囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)過程,與GLUT4的功能密不可分。研究已表明,條件性敲除骨骼肌或脂肪細(xì)胞GLUT4及AS160可導(dǎo)致全身和局部組織的IR。近端腎小管上皮細(xì)胞鈉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(SGLT1)和鈉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2(SGLT2)通過重吸收葡萄糖對(duì)維持機(jī)體糖穩(wěn)態(tài)有重要作用,已成為新型降糖藥物的靶點(diǎn)。因此,針對(duì)糖尿病腎組織中AS160與糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT4及SGLT1/SGLT2的研究有助于探索腎臟IR的分子機(jī)制,以期為早期干預(yù)糖尿病腎損害和改善DN預(yù)后提供可能的分子靶點(diǎn)。我們前期研究結(jié)果顯示,NF-KB抑制劑倍半萜內(nèi)酯(PTN)可以改善糖尿病小鼠全身IR及腎臟病理損傷,其是否對(duì)腎臟IR有作用及可能的機(jī)制尚未見報(bào)道。研究目的：在db/db糖尿病腎病小鼠基礎(chǔ)上研究糖尿病腎組織是否存在AS160與糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT4及SGLT1/SGLT2導(dǎo)致的胰島素抵抗。了解NF-KB抑制劑PTN是否可以改善糖尿病腎組織IR,進(jìn)而延緩DN進(jìn)展。研究方法：建立db/db糖尿病腎病小鼠模型并設(shè)立PTN干預(yù)組。將小鼠分為三組：對(duì)照組(db/m+NS)、糖尿病腎病組(db/db+NS)、PTN干預(yù)組(db/db+PTN)。所有小鼠在8周齡開始進(jìn)入實(shí)驗(yàn),分別在處理的T0(8周齡)、T4(12周齡)T8(16周齡)及T12(20周齡)留取血清、尿液及腎組織標(biāo)本。利用實(shí)時(shí)定量PCR、免疫組化／熒光、免疫印跡(WB)等方法檢測(cè)小鼠AS160、p-AS160 (Thr642) 及糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT4、SGLT1/SGLT2在糖尿病腎組織中的表達(dá)情況；對(duì)AS160/p-AS160與GLUT4、SGLT1/SGLT2進(jìn)行共定位,初步探索AS160對(duì)腎臟糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控情況,了解AS160在糖尿病腎組織胰島素抵抗中的作用。研究結(jié)果：(1)db/db小鼠糖尿病腎病模型建立成功。自8周齡起,db/db小鼠體重即高于db/m小鼠。隨著周齡增加,db/db小鼠表現(xiàn)出尿蛋白增加,高血脂、高血糖、高胰島素血癥,以及腎小球肥大、系膜基質(zhì)增多等生化和腎臟病理改變。(2)免疫組化和免疫熒光顯示AS160在腎臟有表達(dá),主要表達(dá)在腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)的腎小管中,在腎小球的鮑曼氏囊上皮細(xì)胞側(cè)可見較弱的表達(dá)。AS160蛋白在db/m小鼠腎臟的表達(dá)不隨周齡增加而改變。而在db/db、鼠,AS160蛋白表達(dá)較db/m小鼠輕度增加。給予PTN干預(yù)后,兩組并無明顯差別。免疫組化測(cè)定db/db小鼠AS160蛋白水平表達(dá)：8w 1.22±0.26,12w 1.27±0.38,16w 1.35±0.25,20w1.22±0.30。給予PTN干預(yù)0周、4周、8周及12周后AS160蛋白表達(dá)為T0(8w)1.17±0.22,T4(12w)1.22±0.31,T8(16w)1.24±0.39,T12(20w)1.03±0.35。(3)免疫熒光顯示p-AS160 (phospho T642)主要分布在腎皮質(zhì)小管的管腔側(cè),在髓質(zhì)腎小管的表達(dá)較弱,而在腎小球未見陽性表達(dá)。腎臟中p-AS160蛋白表達(dá)在db/db小鼠早期(8w)高于db/m小鼠,但隨著周齡的增加,其表達(dá)呈下降趨勢(shì)。給予db/db小鼠PTN干預(yù)后,p-AS160的下降趨勢(shì)有所改善。免疫組化顯示db/db小鼠腎臟p-AS160表達(dá)為：8w 1.55±0.30,12w 1.18±0.22,16w 1.06±0.20,20w0.98±0.18。給予PTN干預(yù)0周、4周、8周及12周后p-AS160表達(dá)為TO(8w)1.54±0.32,T4(12w)1.42±0.26,T8(16w)1.41±0.21,T12(20w)1.34±0.08。(4)免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示GLUT4同樣以腎小管為主要表達(dá)部位,皮質(zhì)和髓質(zhì)腎小管均有表達(dá),腎小球未見陽性表達(dá)。GLUT4在db/m小鼠腎臟表達(dá)不隨周齡增加而改變；但在db/db小鼠,GLUT4無論是在mRNA水平還是在蛋白水平,均表現(xiàn)出早期(8周齡)升高,隨著周齡的增加,表達(dá)逐漸降低的趨勢(shì)。而PTN可以增加DN小鼠腎臟GLUT4的表達(dá)。GLUT4 mRNA與GLUT4蛋白在不同周齡db/db小鼠腎臟表達(dá)情況分別為：GLUT4mRNA水平8w 1.79±0.25,12w 1.32±0.33,16w 0.98±0.23,20w 1.00±0.12；GLUT4蛋白水平8w 1.32±0.28,12w 1.05±0.47,16w 0.85±0.10,20w 0.88±0.25。PTN干預(yù)db/db小鼠0周(TO)、4周(T4)、8周(T8)及12周(T12)后GLUT4蛋白表達(dá)分別為T0(8w)1.31±0.21,T4(12w)1.20±0.39,T8(16w)1.42±0.43,T12(20w)1.53±0.15。(5)免疫熒光共染顯示AS160及p-AS160 ((phospho T642)均與部分GLUT4在腎小管上皮細(xì)胞有共表達(dá)。雖然SGLT1/SGLT2主要表達(dá)在近端腎小管管腔側(cè),但p-AS160與SGLT1僅有少量的共表達(dá),與SGLT2在腎小管上皮細(xì)胞無共表達(dá)。研究結(jié)論：(1)db/db糖尿病腎病小鼠模型具有全身胰島素抵抗的特點(diǎn),并伴有糖尿病腎病病理改變。給予PTN干預(yù)后可改善其全身全身胰島素抵抗情況及腎臟病理變化。(2)AS160及其功能形式p-AS160在腎臟有表達(dá),以腎小管為主要表達(dá)部位。隨著DN小鼠周齡增加,p-AS160糖尿病腎組織的表達(dá)逐漸降低。(3)GLUT4在小鼠腎臟主要表達(dá)腎小管中,其在db/db小鼠腎臟表達(dá)呈降低趨勢(shì)。部分GLUT4與AS160及P-AS160在腎小管上皮細(xì)胞有共表達(dá),提示腎臟可能存在AS160調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。(4)給予PTN干預(yù)后,糖尿病腎組織p-AS160與GLUT4表達(dá)增加,提示PTN可能通過增加糖轉(zhuǎn)運(yùn),改善糖尿病腎組織糖代謝及胰島素敏感性。(5) SGLT1/SGLT21與p-AS160(Thr 642)無明顯共表達(dá),考慮AS160并不參與SGLT1/SGLT2的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控或不是其主要調(diào)控蛋白。研究目的：準(zhǔn)確評(píng)價(jià)兒童腎功能對(duì)兒童腎臟疾病早期診斷、早期治療具有重要意義。中國成人估算腎小球?yàn)V過率公式(eGFR)在臨床上的應(yīng)用相對(duì)成熟，而國外兒童GFR估算公式在我國兒童人群中的應(yīng)用并未得到驗(yàn)證。目前我國關(guān)于兒童GFR測(cè)定方法的研究較少，我國仍缺乏一種準(zhǔn)確評(píng)價(jià)兒童腎功能的方法。碘海醇血漿清除率已被證實(shí)是測(cè)定腎小球?yàn)V過率(GFR)的可靠方法，然而該方法在中國尚未被廣泛應(yīng)用及推廣。本課題前期工作己建立利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定血清碘海醇濃度的方法，該方法穩(wěn)定可靠。本研究擬在慢性腎臟病兒童中以99m7c-DTPA血漿清除率為參照評(píng)價(jià)碘海醇清除率評(píng)估兒童腎小球?yàn)V過率的準(zhǔn)確性；評(píng)估單次采血法和干血濾紙片法在碘海醇清除率應(yīng)用中的可行性。研究方法：設(shè)定HPLC色譜條件，建立碘海醇血清濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性、方法的精密度、真實(shí)性進(jìn)行驗(yàn)證。納入慢性腎臟病兒童33例(前期工作已納入12例，總共45例)，同時(shí)進(jìn)行99mc-DTPA清除率與碘海醇血漿清除率測(cè)定，即分別在99mTc-DTPA和碘海醇注射后2h和4h以及2h和5h進(jìn)行兩次采血測(cè)量99mTc-DTPA和碘海醇血漿清除率。評(píng)價(jià)兩種方法測(cè)得的腎小球?yàn)V過率的相關(guān)性和一致性。對(duì)碘海醇單次采血法(2h)與碘海醇雙次采血法(2h和5h)進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)單次采血的可行性。對(duì)13例患兒同時(shí)采用干血濾紙片法測(cè)定碘海醇清除率，并與碘海醇雙次采血法進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)干血斑濾紙片碘海醇清除率可行性。研究結(jié)果：(1)本研究建立的HPLC法側(cè)定碘海醇濃度在10～1000mg/L范圍內(nèi)線性良好(R2=0.9998)，該方法的精密度、真實(shí)性較好(批間誤差與批內(nèi)誤差RSD%5%,平均回收率R%96%)。(2)45例患兒均完成碘海醇血漿清除率測(cè)定。其中36例患兒同時(shí)完成99mTc-DTPA血漿清除率測(cè)定，13例患兒完成干血濾紙片碘海醇清除率測(cè)定。(3)碘海醇血漿清除率與99mTc-DTPA血漿清除率比較，兩者有很好的相關(guān)性(r=0.941,P0.01)，兩者結(jié)果的差值較小，為(6.53±11.6)ml/(min. 1.73m2)。(4)單次采血與雙次采血測(cè)得的碘海醇清除率相關(guān)性為r=0.958,差值為(4.26±9.06)ml/(min. 1.73m2)。(5)干血濾紙片碘海醇清除率與血清碘海醇清除率比較,兩者相關(guān)性為r＝0.95,差值為(0.48±10.89)ml/(min. 1.73m2)。研究結(jié)論：碘海醇血漿清除率與99mTc-DTPA血漿清除率之間的相關(guān)性及一致性較好，是一種理想的評(píng)估腎功能的方法。單次采血法與千血濾紙片法使碘海醇清除率測(cè)定更簡(jiǎn)便、可行。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

算的血清艦海醇濃度的平均值為巧３．?６７?＋?３５．?８２）?ｕｇ／ｍｌ，實(shí)際血清賄海醇的濃??度為（６６．?１８?＋?４６．０４）?Ｐｇ／ｍｌ，兩者差值為但．５１?±１３．０７）?ｕｇ／ｍｌ，相關(guān)系數(shù)為??廠０．?９８０?（代０．?０１）（圖６）。進(jìn)一步對(duì)１３例患兒采用干血濾紙片法測(cè)定的柳海??醇清除率與血清柳海醇清除率進(jìn)行比較，結(jié)果思示兩種方法測(cè)定ＧＦＲ值分別為??（１１日．８２±３２．?７１）ｍｌ／?（ｍｉｎ．?１．巧ｍ２）和（１１０．?３３±：３５．２８）ｍｌ／?（ｍｉｎ．?１．７３ｍ２），差??值為化４８±１０．８９）１１１１／（１１１１〇．１．７３１１１２），差值的９５％（？／為－６．１曠７．０６。兩種方法??回歸方程為?ｙ＝〇．?８８２?Ｘ?＋１３．?４９７，相關(guān)性為?／－０．?９５０?（／＜０．?０１），ＲＭＳＥ＝１０．?５１?ｍｌ／??（１１１１〇．１．７３１１１２）（圖７）。６１３〇（１－４１＊１１１３〇分析顯示９５％１０４為［－２０．９，２１．引（圖??８）。兩種方法得出規(guī)海醇清除率的ＩＣＣ＝０．?９７８?（八０．?０１）。規(guī)海醇干血濾紙片血??漿清除率位于規(guī)海醇雙次取血血漿清除率＋１５％與±?３０％區(qū)間內(nèi)的比例分別為??８４．?６１％和?１００％?（表?２）。??２００?－??＊〇?＊?…?ｙ?＝?０．７６２４ｘ＋１３＾１２?，??言Ｉ?ｒ?＝。沸??鳴貿(mào)Ｅ?＾??梓?〇?１欲＞?－??獄宮Ｓ?乂??理－Ｉ??度?ｇ?—?５０?－??與立??＋?１?／??巧?Ｉ?＞?■?■?■?＇??０?５０

算的血清艦海醇濃度的平均值為巧３．?６７?＋?３５．?８２）?ｕｇ／ｍｌ，實(shí)際血清賄海醇的濃??度為（６６．?１８?＋?４６．０４）?Ｐｇ／ｍｌ，兩者差值為但．５１?±１３．０７）?ｕｇ／ｍｌ，相關(guān)系數(shù)為??廠０．?９８０?（代０．?０１）（圖６）。進(jìn)一步對(duì)１３例患兒采用干血濾紙片法測(cè)定的柳海??醇清除率與血清柳海醇清除率進(jìn)行比較，結(jié)果思示兩種方法測(cè)定ＧＦＲ值分別為??（１１日．８２±３２．?７１）ｍｌ／?（ｍｉｎ．?１．巧ｍ２）和（１１０．?３３±：３５．２８）ｍｌ／?（ｍｉｎ．?１．７３ｍ２），差??值為化４８±１０．８９）１１１１／（１１１１〇．１．７３１１１２），差值的９５％（？／為－６．１曠７．０６。兩種方法??回歸方程為?ｙ＝〇．?８８２?Ｘ?＋１３．?４９７，相關(guān)性為?／－０．?９５０?（／＜０．?０１），ＲＭＳＥ＝１０．?５１?ｍｌ／??（１１１１〇．１．７３１１１２）（圖７）。６１３〇（１－４１＊１１１３〇分析顯示９５％１０４為［－２０．９，２１．引（圖??８）。兩種方法得出規(guī)海醇清除率的ＩＣＣ＝０．?９７８?（八０．?０１）。規(guī)海醇干血濾紙片血??漿清除率位于規(guī)海醇雙次取血血漿清除率＋１５％與±?３０％區(qū)間內(nèi)的比例分別為??８４．?６１％和?１００％?（表?２）。??２００?－??＊〇?＊?…?ｙ?＝?０．７６２４ｘ＋１３＾１２?，??言Ｉ?ｒ?＝。沸??鳴貿(mào)Ｅ?＾??梓?〇?１欲＞?－??獄宮Ｓ?乂??理－Ｉ??度?ｇ?—?５０?－??與立??＋?１?／??巧?Ｉ?＞?■?■?■?＇??０?５０
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本文編號(hào)：2874479