背景：人類認知功能隨著衰老而逐漸下降。腦是性激素的重要靶器官。性激素不僅影響腦生殖相關(guān)區(qū)域(如下丘腦、垂體)的功能,而且對認知功能也有調(diào)節(jié)作用。絕經(jīng)期女性由于卵巢功能衰退,雌、孕激素水平降低,認知功能顯著下降。研究顯示,圍絕經(jīng)期婦女輕度認知功能障礙(Mild cognitive impairment, MCI)和阿爾茲海默病(Alzheimer's Disease, AD)的發(fā)病率顯著升高；絕經(jīng)后,62%-70%的婦女會出現(xiàn)認知能力的下降。此外,過早絕經(jīng),特別是手術(shù)絕經(jīng)(低于45歲)可以增加認知能力下降及癡呆的發(fā)生風險；絕經(jīng)年齡越低,其風險值越高。因此,“國際絕經(jīng)協(xié)會(International menopausal society, IMS)關(guān)于絕經(jīng)后激素治療的最新建議”推薦過早絕經(jīng)的女性應(yīng)該接受激素替代治療(Hormone replacement therapy, HRT)直至自然絕經(jīng)年齡。認知功能下降不僅與自然衰老有關(guān),也與性激素的缺失密切相關(guān)。激素替代治療(HRT)有望成為預(yù)防和治療絕經(jīng)期認知功能下降的有效手段。HRT應(yīng)用于臨床的幾十年中,其發(fā)展經(jīng)歷了極其曲折的過程,也取得了一些成績。目前,HRT被認為是緩解絕經(jīng)相關(guān)癥狀(如血管舒縮癥狀、泌尿生殖道萎縮、骨質(zhì)丟失等)最有效的方法。但是,HRT對認知功能下降,如輕度認知功能障礙、阿爾茲海默病等的影響還有待進一步研究。隨著人口老齡化,我國絕經(jīng)期婦女人數(shù)已經(jīng)超過1億。有關(guān)HRT對大腦認知功能調(diào)節(jié)的研究具有重要意義。HRT孕激素種類及治療時機的選擇可能影響其對認知功能的調(diào)節(jié)作用。2003年,WHI (Women's Health Initiative,美國婦女健康倡議)公布的數(shù)據(jù)顯示,結(jié)合雌激素聯(lián)合醋酸甲羥孕酮不但不能預(yù)防絕經(jīng)后退行性認知功能減退,反而會增加AD的發(fā)病風險。這與既往觀念大相徑庭,引起了醫(yī)療界的廣泛關(guān)注。對有完整子宮的絕經(jīng)后婦女,HRT中孕激素的添加是必需的,可以預(yù)防子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。大量研究表明,雌激素(Estrogen, E2)可以改善絕經(jīng)后認知功能下降；但是孕激素對大腦認知功能的調(diào)節(jié)作用目前尚沒有確切結(jié)論。對WHI研究結(jié)果進行分析后認為,醋酸甲羥孕酮(MPA)的使用與其負性實驗結(jié)果有關(guān)。不同的孕激素對大腦認知功能的調(diào)節(jié)作用不同。動物實驗表明,MPA單獨或聯(lián)合雌激素使用可以損害去卵巢(Ovariectomy, OVX)動物大腦認知功能。WHI研究中其研究對象的年齡較大(平均63.3歲),錯過了激素替代治療的最佳時機。進一步的研究闡明孕激素種類及治療時機對HRT調(diào)節(jié)認知功能作用的影響,將對臨床HRT應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。地屈孕酮(Dydrogesterone, DG)是第三代合成孕激素。其分子結(jié)構(gòu)與天然孕激素非常接近,能與孕激素受體(Progesterone receptor, PR)特異性結(jié)合。與天然孕酮相比,地屈孕酮的口服生物利用度高,臨床應(yīng)用更方便；與MPA相比,DG不與雌激素受體(ER),雄激素受體(AR)及糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合,副作用小。臨床研究表明,地屈孕酮對絕經(jīng)后女性子宮內(nèi)膜有保護作用,對其他組織器官(如心血管,乳腺組織等)不良影響較小,有很大的應(yīng)用潛力。動物實驗也顯示,地屈孕酮對使用雌激素的OVX大鼠的子宮有保護作用,并且可以提高大鼠腦內(nèi)四氫孕酮(Allopregnanolone,具有神經(jīng)活性的孕激素代謝產(chǎn)物)的含量。但是,目前尚無地屈孕酮對絕經(jīng)后認知功能的影響的研究。建立合適的絕經(jīng)動物模型,對了解絕經(jīng)期認知功能下降的發(fā)生、預(yù)防和治療有重要的意義。本研究通過了解雌性SD大鼠在不同月齡的卵巢功能狀態(tài)和基礎(chǔ)認知水平,選取合適鼠齡的大鼠建立絕經(jīng)模型。采用動物行為學(xué)測試的方法,觀察地屈孕酮對不同鼠齡大鼠絕經(jīng)模型認知功能的影響；并通過觀察治療后子宮重量及乳腺結(jié)構(gòu)的變化,評估地屈孕酮對大鼠子宮及乳腺的影響；運用分子生物學(xué)實驗方法,初步探討了地屈孕酮發(fā)揮認知調(diào)節(jié)作用的可能機制。為激素替代治療(HRT)在改善絕經(jīng)期認知功能中的應(yīng)用提供有價值的實驗室依據(jù)。第一部分大鼠絕經(jīng)模型的建立采用去卵巢(OVX)的方式建立大鼠絕經(jīng)模型。大量臨床及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)顯示,HRT治療存在治療時間窗(Window of opportunity),即在特定時間給藥治療效果最佳；本研究通過系統(tǒng)地評估不同月齡雌性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)的卵巢功能狀態(tài)和基礎(chǔ)認知水平,選取處于不同衰老時期的大鼠建立絕經(jīng)模型,模擬人類絕經(jīng)期前后不同階段的內(nèi)分泌狀態(tài),以進一步研究地屈孕酮在HRT治療中對大腦認知功能的影響及其機制。1.不同月齡SD大鼠卵巢功能和認知水平評估目的：采用陰道細胞涂片(Vaginal smear)的方法觀察雌性SD大鼠在不同鼠齡的卵巢功能狀態(tài)；通過動物行為學(xué)測試了解雌性SD大鼠在不同鼠齡的基礎(chǔ)認知水平。為大鼠絕經(jīng)模型的建立選取合適鼠齡的大鼠。實驗方法：通過陰道細胞涂片將發(fā)情周期規(guī)律的成年雌性SD大鼠分為如下四組：P組(Proestrus,發(fā)情前期)、E組(Estrus,發(fā)情期)、M組(Mestrus,發(fā)情后期)和D組(Diestrus,發(fā)情間期),每組8只。采用Morris水迷宮(1-day)和曠場實驗的方法檢測規(guī)律發(fā)情周期內(nèi)不同時相雌性大鼠的認知行為。選取3月齡、7月齡、12月齡、18月齡、24月齡健康雌性SD大鼠,每組8只。通過陰道細胞涂片的方法,觀察不同鼠齡大鼠的發(fā)情周期,評價其卵巢功能狀態(tài)。采用經(jīng)典Morris水迷宮及曠場實驗方法測試各月齡組大鼠認知能力水平。結(jié)果：1.健康成年大鼠發(fā)情周期不同時相的認知行為表現(xiàn)沒有顯著性差異。Morris水迷宮(1-day)結(jié)果顯示,處于不同周期時相的各組大鼠逃避潛伏期及游泳速度無統(tǒng)計學(xué)差異；目標象限時間百分比及穿越平臺次數(shù)也無統(tǒng)計學(xué)差異。曠場實驗指標在各組大鼠之間均沒有顯著差異。發(fā)情周期內(nèi)性激素水平的波動對成年大鼠的認知行為沒有顯著影響。2.大鼠發(fā)情周期隨月齡增加發(fā)生變化。3月齡、7月齡大鼠發(fā)情周期規(guī)律,周期長4-6天；每個周期分四個階段：動情前期、動情期、動情后期和動情間期。12月齡大鼠雖然發(fā)情周期依然存在,但周期長短無規(guī)律；18月齡大鼠發(fā)情周期紊亂,處于持續(xù)發(fā)情間期或假孕狀態(tài)；24月齡大鼠周期消失。提示隨著大鼠月齡增加,卵巢功能逐漸減退。3.大鼠的認知行為(空間學(xué)習及記憶)受鼠齡影響。3月齡和7月齡組大鼠之間認知行為沒有顯著差異。大鼠在12月齡時出現(xiàn)Morris水迷宮逃避潛伏期的顯著延長,目標象限時間縮短；曠場實驗中跨格次數(shù)及站立次數(shù)減少。18月齡、24月齡大鼠認知行為表現(xiàn)進一步減退。2.大鼠絕經(jīng)期模型的建立與評估目的：通過去卵巢手術(shù)(OVX)建立大鼠絕經(jīng)模型,并評估模型建立成功與否。實驗方法：采用去卵巢手術(shù)(Ovariectomy, OVX)方式建立絕經(jīng)模型。選取7月齡、18月齡健康雌性SD大鼠,分別分為三組：空白對照組(C組)、假手術(shù)組(S組)和去卵巢組(OVX組),每組8只。C組大鼠做空白對照組；OVX組大鼠行卵巢切除術(shù),而S組大鼠僅切除卵巢周圍脂肪組織。術(shù)中嚴密觀察大鼠生命體征。術(shù)后行陰道細胞學(xué)涂片觀察發(fā)情周期的變化。術(shù)后1個月,采用經(jīng)典Morris水迷宮和曠場實驗,觀察大鼠術(shù)后認知行為的改變。行為學(xué)測試結(jié)束后,處死大鼠。觀察各組大鼠子宮形態(tài)改變并稱重。結(jié)果1.OVX術(shù)后大鼠發(fā)情周期消失。OVX術(shù)后大鼠陰道細胞涂片逐漸以白細胞為主并持續(xù)5天以上,說明大鼠發(fā)情周期消失,卵巢功能缺失。結(jié)果顯示,術(shù)后15天左右兩個月齡組OVX大鼠發(fā)情周期消失。2.術(shù)后1個月,OVX組大鼠認知功能下降。7月齡大鼠空間學(xué)習能力損害明顯,逃避潛伏期顯著延長(P0.001)；目標象限時間和穿越平臺次數(shù)減少(P0.01)。18月齡組大鼠認知能力也下降,但與對照組相比,沒有統(tǒng)計學(xué)意義。曠場實驗中,18月齡大鼠自發(fā)活動能力較7月齡組下降,跨格次數(shù)及直立次數(shù)減少。去卵巢手術(shù)后,中年大鼠站立次數(shù)顯著減少(P0.05),探索行為減弱。3.術(shù)后1個月,OVX組大鼠子宮形態(tài)和重量發(fā)生變化。與對照組相比,OVX組大鼠子宮體積明顯縮小,呈細線狀,顏色蒼白；子宮重量顯著降低(P0.01)。假手術(shù)組與空白對照組之間沒有顯著性差異。結(jié)論：1.選取即將出現(xiàn)卵巢功能減退及卵巢功能由紊亂至衰竭兩個時期的大鼠,即7月齡和18月齡大鼠,用于絕經(jīng)模型的建立,模擬人類圍絕經(jīng)期前后不同階段的內(nèi)分泌狀態(tài)。2.OVX術(shù)后大鼠發(fā)情周期消失,子宮重量減輕；行為學(xué)測試顯示兩個月齡組大鼠在卵巢切除后均出現(xiàn)了認知行為的改變,以7月齡組大鼠對手術(shù)影響更敏感。絕經(jīng)模型成功建立。第二部分地屈孕酮對大鼠絕經(jīng)模型認知行為的影響及機制研究研究目的：研究地屈孕酮(Dydrogestrone, DG)對大鼠絕經(jīng)模型認知功能的影響及其機制；并通過觀察治療后大鼠子宮重量及乳腺組織結(jié)構(gòu)的變化,評估DG用于激素替代治療(HRT)的安全性；初步探討DG給藥時機對OVX大鼠認知行為的影響。研究方法：將各月齡組大鼠分別分為5組：對照組(Sham組),模型組(OVX組),雌激素治療組(OVX+E2組),雌激素聯(lián)合地屈孕酮治療組(OVX+E2/DG組)和地屈孕酮治療組(OVX+DG組)；每組8只。Sham組和OVX組服用安慰劑,其余3組分別經(jīng)口服給予相應(yīng)激素替代治療：雌激素(17β-estrogen, E2)、雌激素聯(lián)合地屈孕酮(E2/DG)、地屈孕酮(dydrogesterone, DG)。用藥20周后,采用Morris水迷宮和曠場實驗的方法檢測各組大鼠認知行為的差異。用于評價不同激素治療方案對大鼠認知功能的影響。行為學(xué)測試結(jié)束后,將大鼠處死。動物處死后,取大鼠第四對乳腺；乳腺組織經(jīng)福爾馬林固定后,包埋成蠟塊；完整取出大鼠位于腹腔內(nèi)的Y型子宮。乳腺HE染色觀察用藥后各組大鼠乳腺形態(tài)學(xué)改變。稱量子宮重量,用子宮重量(mg)／體重(g)比值評價激素替代對OVX大鼠子宮的影響。部分大鼠經(jīng)斷頭取腦,迅速分離大鼠海馬組織并凍存?zhèn)溆�。其余大鼠灌注取腦,將完整取出的腦組織置福爾馬林溶液中后固定,包埋成蠟塊,切片備用。采用實時定量PCR和ELISA的方法,檢測凍存海馬組織中促炎因子IL-1β和TNF-α表達情況；免疫組織化學(xué)染色的方法檢測海馬組織中NeuN、Iba-1及Aβ1-42表達情況；Tunel檢測海馬組織內(nèi)細胞凋亡情況。結(jié)果：1.地屈孕酮單獨用藥對OVX大鼠認知行為沒有顯著的影響。OVX大鼠與Sham組大鼠相比,逃避潛伏期顯著延長(P0.01),目標象限時間百分比減少(P0.01),即去卵巢術(shù)后大鼠空間認知能力受損。OVX+DG組大鼠與OVX組大鼠相比沒有表現(xiàn)出差異(P=0.132)。單獨使用DG可以減少曠場實驗中央格停留時間(P0.05),但對跨格次數(shù)和直立次數(shù)沒有影響。提示地屈孕酮單獨用藥不能改善OVX大鼠的空間認知能力。2.雌孕激素聯(lián)合給藥后對OVX大鼠認知能力的影響。7月齡組,OVX+E2組大鼠和OVX+E2/DG組大鼠找到平臺所需的時間均比OVX組大鼠顯著縮短(P0.001)；目標象限時間百分和穿越平臺次數(shù)較OVX組大鼠顯著增多(P0.001,P0.05)。曠場實驗中,E2和E2/DG均可以增加中央格停留時間(P0.05)。18月齡組,OVX+E2組大鼠與OVX+E2/DG組大鼠僅空間探索實驗中目標象限停留時間比OVX大鼠增多。結(jié)果提示,地屈孕酮聯(lián)合雌激素治療可以改善OVX大鼠的空間認知能力,減輕大鼠焦慮情緒；7月齡組大鼠對治療的反應(yīng)優(yōu)于18月齡組大鼠；3.地屈孕酮對OVX組大鼠子宮形態(tài)和重量的影響。去卵巢術(shù)后,大鼠子宮重量顯著減輕；地屈孕酮與雌激素聯(lián)合應(yīng)用時,地屈孕酮可以拮抗雌激素的子宮增重作用；地屈孕酮單獨使用時,對OVX大鼠子宮重量無明顯影響。4.地屈孕酮對OVX大鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)的影響。去卵巢導(dǎo)致大鼠乳腺腺體萎縮；雌激素可以顯著減輕乳腺組織萎縮,促進乳腺小葉及導(dǎo)管發(fā)育。OVX+E2/DG組與OVX+E2組大鼠有相同的乳腺組織學(xué)表現(xiàn)；地屈孕酮單獨使用時,乳腺腺體結(jié)構(gòu)與OVX大鼠相似。18月齡對照組大鼠乳腺腺體增生明顯,部分自發(fā)乳腺腫瘤。地屈孕酮不增加乳腺增生的發(fā)生風險。5.各組大鼠海馬炎癥因子表達水平的差異。結(jié)果顯示,18月齡大鼠海馬組織IL-1β和TNFa表達水平比7月齡大鼠高。OVX術(shù)后,炎癥因子IL-1β和TNFa的表達水平均增加,但是18月齡組大鼠增加更明顯。OVX+E2/DG組大鼠炎癥因子水平較OVX組低,而OVX+DG組大鼠的炎癥因子水平明顯高于除OVX組之外的其他各組大鼠。6.各組大鼠海馬小膠質(zhì)細胞表達情況。Iba-1免疫組化結(jié)果顯示,小膠質(zhì)細胞在18月齡對照組大鼠海馬中的數(shù)目比7月齡對照組大鼠明顯增多,活化比例上升。OVX引起7月齡大鼠小膠質(zhì)細胞數(shù)目增多；OVX+E2/DG組大鼠小膠質(zhì)細胞數(shù)目比OVX組減少。18月齡大鼠各組之間差異不顯著。7.各組大鼠海馬組織中Aβ1-42表達變化。Aβ1-42在18月齡對照大鼠海馬中的表達水平高于7月齡對照大鼠。OVX術(shù)后,7月齡大鼠海馬Aβ1-42水平顯著增高,老齡大鼠A β1-42水平有所升高,但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。7月齡大鼠OVX+E2組和OVX+E2/DG組A β1-42水平較OVX組顯著下降,OVX+DG組Aβ1-42水平下降不顯著。8.各組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目及凋亡情況變化。去卵巢手術(shù)后,7月齡組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目顯著減少,18月齡組細胞數(shù)目變化不明顯。海馬CA3區(qū)神經(jīng)元受去卵巢影響較顯著,特別是7月齡組大鼠。OVX+E2和OVX+E2/DG組大鼠神經(jīng)元數(shù)目較OVX組上升；OVX+DG組神經(jīng)元數(shù)目較OVX組略多。細胞凋亡在老齡組較明顯,且以CA3區(qū)最為顯著。結(jié)論：1.地屈孕酮(DG)單獨替代不能改善OVX大鼠的認知行為；2.E2/DG治療可以改善OVX大鼠認知行為,發(fā)揮子宮保護作用的同時不增加乳腺增生的風險；3.HRT對認知功能的調(diào)節(jié)作用與OVX大鼠的鼠齡有關(guān)；7月齡組大鼠E2及E2/DG的治療效果比18月齡組大鼠好。E2/DG對治療絕經(jīng)期認知功能下降有潛在的臨床應(yīng)用價值,特別對提早絕經(jīng)者更有必要；4.E2/DG治療可以有效緩解去卵巢引起的大鼠海馬炎癥反應(yīng)及細胞凋亡；5.去卵巢引起的海馬炎癥反應(yīng)增強,可能與OVX術(shù)后認知功能障礙有關(guān)；地屈孕酮對認知功能發(fā)揮作用與其對海馬炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R711.75;R-332
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號說明
第一部分 SD大鼠去卵巢絕經(jīng)模型的建立
    前言
    1. 不同月齡SD大鼠卵巢功能和認知水平評估
        材料與方法
        結(jié)果
        討論
        結(jié)論
    2. 大鼠絕經(jīng)期模型的建立與評估
        材料與方法
        結(jié)果
        討論
        創(chuàng)新性和局限性
        結(jié)論
    附圖表
    參考文獻
第二部分 地屈孕酮對不同鼠齡大鼠絕經(jīng)模型認知行為的影響及其機制研究
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    創(chuàng)新性與局限性
    結(jié)論
    附圖表
    參考文獻
致謝
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本文編號：2873201