目的:骨骼肌和肝臟是葡萄糖代謝的主要外周組織,對維持機體血糖穩(wěn)態(tài)具有重要作用。代謝異�？蓪е卵装Y以及胰島素抵抗,長期的炎癥和胰島素抵抗相互作用可誘發(fā)2型糖尿病,其機制涉及傳統(tǒng)的胰島素靶組織以及免疫細胞和血管內皮。胰島素和運動/肌肉收縮是兩種調節(jié)血糖的生理性作用,胰島素抵抗時胰島素促進的胰島靶組織如骨骼肌攝取葡萄糖能力下降,而運動/肌肉收縮促進的骨骼肌攝取葡萄糖作用不受影響,相比于胰島素,運動/肌肉收縮促進的骨骼肌葡萄糖攝取的機制尚不明確。此外,腸道菌群酵解食物中的膳食纖維和抗性淀粉等產生的短鏈脂肪酸具有降低體重和增加胰島素敏感性及抗炎的作用,但其對胰島素靶組織以及內皮細胞的具體作用機制尚不明確。本研究探討肌肉收縮升高胞漿鈣離子濃度調節(jié)骨骼肌攝取葡萄糖的分子機制,以及短鏈脂肪酸對骨骼肌、肝臟、內皮細胞糖代謝和炎癥的影響。方法:第一部分,應用穩(wěn)定過表達GLUT4myc的L6-GLUT4myc、過表達AS160的L6-GLUT4myc-AS160 WT、過表達AS160 4A(四個位點突變而不能被磷酸化)的L6-GLUT4myc-AS160 4A大鼠骨骼肌細胞,探討鈣信號調節(jié)骨骼肌細胞葡萄糖攝取的分子機制。應用RNA干擾技術分別下調L6-GLUT4myc細胞PKCδ、PKCδ和PKCε、PKCα、PKCθ、Rab10、Rab13蛋白表達,1μM鈣離子載體ionomycin孵育細胞10分鐘,ELISA檢測細胞表面GLUT4myc、GLUT4myc內吞和外排,Western blot檢測PKCε、PKCδ、PKCα、PKCθ、Rab10、Rab13、GLUT4、AS160蛋白表達,以及AS160、TBC1D1、AMPK、CaMKII的磷酸化水平。第二部分,探討短鏈脂肪酸對骨骼肌代謝和炎癥的影響。分別應用不同濃度的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉孵育L6-GLUT4myc大鼠骨骼肌細胞24小時,ELISA檢測細胞表面GLUT4myc水平,Western blot檢測GLUT4蛋白表達以及AMPK、ACC的磷酸化水平。應用棕櫚酸與乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉共孵育細胞24小時,Western blot檢測NF-κB、JNK的磷酸化水平和SOCS3蛋白表達。第三部分,探討短鏈脂肪酸對肝細胞代謝的影響。分別應用不同濃度的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉孵育AML12小鼠肝細胞24小時,Western blot檢測AMPK、ACC、GSK-3β的磷酸化水平。第四部分,探討丙酸對內皮細胞炎癥分子的影響。應用棕櫚酸與丙酸鈉共孵育HUVEC人臍靜脈內皮細胞24小時,Western blot檢測AMPK、NF-κB、JNK的磷酸化水平。結果:第一部分結果顯示,骨骼肌細胞中,siPKCδ不影響ionomycin促進的GLUT4myc轉位,siPKCα和siPKCθ可分別抑制ionomycin促進的AS160和TBC1D1的磷酸化,AS160 4A抑制ionomycin促進的GLUT4myc轉位,siRab10不影響ionomycin促進的GLUT4myc轉位,siRab13抑制ionomycin促進的GLUT4myc外排。第二部分結果顯示,乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉可增加骨骼肌細胞表面GLUT4myc水平和GLUT4蛋白表達,促進AMPK和ACC磷酸化,抑制棕櫚酸誘導的JNK的磷酸化,并且丙酸鈉和丁酸鈉可抑制棕櫚酸誘導的NF-κB的磷酸化,丙酸鈉可抑制棕櫚酸誘導的SOCS3蛋白表達。第三部分結果顯示,乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉可促進小鼠肝細胞AMPK、ACC的磷酸化,丁酸鈉可促進GSK-3β的磷酸化,而乙酸鈉和丙酸鈉不影響GSK-3β的磷酸化。第四部分結果顯示,在內皮細胞中,丙酸鈉可磷酸化AMPK,抑制棕櫚酸誘導的NF-κB和JNK的磷酸化。結論:1、大鼠骨骼肌細胞中,PKCδ不參與鈣信號刺激的GLUT4轉位;PKCα和PKCθ參與鈣信號促進的AS160和TBC1D1的磷酸化;AS160參與鈣信號調節(jié)的GLUT4轉位;Rab10不參與鈣信號調節(jié)的GLUT4轉位;Rab13參與鈣信號調節(jié)的GLUT4外排。2、大鼠骨骼肌細胞中,短鏈脂肪酸可促進GLUT4轉位,增加GLUT4蛋白表達,促進AMPK和ACC的磷酸化,抑制棕櫚酸誘導的JNK和NF-κB的激活以及SOCS3的表達。3、小鼠肝細胞中,短鏈脂肪酸可促進AMPK、ACC、GSK-3β的磷酸化。4、內皮細胞中,丙酸可促進AMPK的磷酸化,抑制棕櫚酸誘導的JNK和NF-κB激活。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

mycin 增加 L6-GLUT4myc 成肌細胞膜影響Cδ、200nM siPKCδ+ε 或 siNR 60 小ionomycin 組，如方法所述，WesteGLUT4myc 水平。n=4-5，***p<0.0 對 ionomycin 刺激的 AS160 和 TBC明，cPKC 中的 PKCα 和 nPKC 中的接下來本研究將探討 PKCα 和 PKC酸化的影響。將細胞分為基礎組（DCθ 或 siNR，Western blot 檢測相關顯示 siPKCα 組 PKCα 蛋白表達量）。Ionomycin 顯著增加 AS160 T64組的 2.68±0.21 倍（p<0.001）和Cα 不影響基礎狀態(tài) AS160 和 TBC

19圖 1.2 siPKCα 對 ionomycin 磷酸化 AS160 和 TBC1D1 作用的影響將分別轉染 150nM siPKCα 或 siNR 60 小時的 L6-GLUT4myc 細胞無血清培養(yǎng) 3小時，向上述溶液中加入 1 μM ionomycin 或 DMSO 孵育 10 分鐘后裂解細胞，Western blot 檢測目的蛋白。n=3，*p<0.05，***p<0.001，ns 表示無統(tǒng)計學意義。同樣的，Western blot 結果顯示 siPKCθ 組 PKCθ 蛋白表達量為 siNR 組的

0.22±0.03 倍（p<0.001，圖 1.3A）。Ionomycin 顯著增加 AS160 T642 和 TBC1DT596 的磷酸化，分別為基礎組的 2.82±0.13 倍（p<0.001）和 1.66±0.19 倍（p<0.05（圖 1.3B，C）。siPKCθ 不影響基礎狀態(tài)下 AS160 和 TBC1D1 的磷酸化，但顯著抑制 ionomycin 磷酸化 AS160 和 TBC1D1 的作用，分別為 siNR 條件下ionomycin 組的 0.39±0.03 倍（p<0.001）和 0.40±0.10 倍（p<0.05）（圖 1.3B，C）此外 siPKCθ 既不影響 GLUT4 蛋白表達，也不影響 ionomycin 促進的 AMPK 和CaMKII 的磷酸化（圖 1.3D-F）。
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本文編號：2870825