背景:Behcet病(Behcet's Disease,BD)是一種以反復(fù)發(fā)作的口腔潰瘍、生殖器潰瘍、葡萄膜炎、皮膚病變等多系統(tǒng)損害為主要臨床表現(xiàn)的慢性炎癥性自身免疫性疾病。該疾病好發(fā)于中青年人群,其中很多患者會(huì)發(fā)生不可逆的盲目,很大程度上降低了患者的生活質(zhì)量,加重了社會(huì)負(fù)擔(dān),因此對(duì)BD的研究具有重要的社會(huì)意義。BD的確切病因尚不清楚,目前研究表明BD是在遺傳和環(huán)境感染因素上發(fā)生的自身炎癥性免疫反應(yīng)。Th17細(xì)胞過度活化、Th1細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例失衡所致的異常免疫反應(yīng)是BD發(fā)生的主要發(fā)病基礎(chǔ)。近年來大量研究表明腸道微生物在調(diào)節(jié)宿主Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞中起著至關(guān)重要的作用。腸道微生物菌群失調(diào)可能導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生,包括BD的發(fā)生。雖然已有研究者利用16S rRNA基因的保守性與特異性對(duì)BD患者進(jìn)行腸道微生物菌群差異的研究,然而卻未對(duì)BD患者腸道微生物菌群進(jìn)行功能方面的研究。并且基于16SrRNA測序研究腸道微生物的方法有較大的局限性,而基于宏基因組學(xué)研究腸道微生物不但可以更全面的分析腸道微生物的結(jié)構(gòu),同時(shí)能進(jìn)行腸道微生物功能方面的研究。本課題正是基于上述背景,進(jìn)行了以下三個(gè)方面的研究:(1)利用16S rRNA測序方法研究免疫抑制劑對(duì)活動(dòng)期BD患者腸道微生物的影響,以指導(dǎo)本課題宏基因組學(xué)研究中BD患者的納入標(biāo)準(zhǔn)。(2)利用宏基因組學(xué)測序方法分析BD患者與正常人腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能的差異,探討影響B(tài)D發(fā)生的腸道微生物菌群及可能的微生物作用機(jī)制。(3)利用16S rRNA測序方法分析BD患者和正常人口腔微生物結(jié)構(gòu)差異,明確口腔微生物是否參與BD的發(fā)生,以及BD患者口腔微生物與腸道微生物間的相互關(guān)系。第一部分免疫抑制劑對(duì)活動(dòng)期BD患者腸道微生物影響的研究目的:利用16S rRNA測序方法研究免疫抑制劑對(duì)活動(dòng)期BD患者腸道微生物的影響,以指導(dǎo)本課題宏基因組學(xué)研究中BD患者的納入標(biāo)準(zhǔn)。方法:分別收集活動(dòng)期未用藥BD患者、活動(dòng)期已用藥BD患者、正常人糞便。提取糞便DNA,PCR擴(kuò)增后采用Illumina MiSeq測序儀行16S rRNA測序。對(duì)16S rRNA測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果:活動(dòng)期未用藥BD患者與正常人腸道微生物的差異在操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)顯著性差異分析、微生物物種顯著性差異分析及線性判別分析效應(yīng)大小(Linear Discriminate Analysis Effect Size,LEfSe)分析上均高于活動(dòng)期已用藥BD患者與正常人腸道微生物的差異。活動(dòng)期未用藥BD患者與活動(dòng)期已用藥BD患者組間也存在顯著性差異。結(jié)論:藥物免疫抑制劑對(duì)活動(dòng)期BD患者腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)有影響。藥物治療在一定程度上能夠扭轉(zhuǎn)活動(dòng)期BD患者腸道微生物失衡的狀態(tài)。因此,在后期研究中我們嚴(yán)格篩選活動(dòng)期未用藥BD患者作為本研究的研究對(duì)象。第二部分BD患者腸道微生物宏基因組學(xué)研究目的:利用宏基因組測序技術(shù)分析分析BD患者與正常人腸道微生物結(jié)構(gòu)及功能的差異,明確參與BD發(fā)生的微生物菌群,以及這些異常的腸道微生物菌群通過何種機(jī)制參與疾病的發(fā)生。方法:分別收集活動(dòng)期未用藥BD患者、正常人糞便。提取糞便DNA,采用Illmina TruSeq測序儀行宏基因組測序。對(duì)宏基因組測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果:1、對(duì)宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)微生物差異物種結(jié)果顯示BD患者和正常人腸道微生物間分別有248個(gè)菌屬和933個(gè)菌種存在顯著性差異。其中,產(chǎn)乳酸菌和硫酸鹽還原菌及低豐度的條件致病菌為BD患者富集的腸道微生物菌種,而產(chǎn)丁酸菌產(chǎn)甲烷菌為正常人富集的腸道微生物菌種。2、通過基因群物種(Metagenomic species,MGS)分析顯示BD患者與正常人腸道微生物間存在有13個(gè)顯著性差異的MGS。用這些MGS區(qū)分BD患者組與正常人組,得到接受者操作特征曲線下的面積(area under the receiver operating characteristic curve,AUC)為82.69%(95%可信區(qū)間:71.24%-94.14%)。3、結(jié)合京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和基因進(jìn)化譜系:非監(jiān)督基因自系同源簇(Evolutionary Genealogy of Genes:Non-supervised Orthologous Groups,eggNOG)數(shù)據(jù)集分析,發(fā)現(xiàn)BD患者與正常人腸道微生物存在449個(gè)顯著性差異的KEGG同源基因(KEGG Orthologues,KO)和1859個(gè)顯著性差異的EggNOG同源基因(EggNOG Orthologues,OG)。BD患者在膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝方面富集。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)2個(gè)與熱休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)相關(guān)的OG在BD中富集,而一個(gè)與熱休克蛋白20(Heat shock protein 20,HSP20)相關(guān)的KO在正常人中富集。在模塊和路徑水平,我們發(fā)現(xiàn)BD患者在肽聚糖合成系統(tǒng)、硫和脂質(zhì)代謝、囊多糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、細(xì)菌Ⅲ型和Ⅳ型分泌系統(tǒng)方面富集。結(jié)論:BD患者與正常人腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能均存在差異。在腸道微生物結(jié)構(gòu)上,BD患者富集產(chǎn)乳酸菌和硫酸鹽還原菌以及低豐度的條件致病菌,而缺乏產(chǎn)丁酸菌和產(chǎn)甲烷菌。對(duì)腸道微生物功能的研究發(fā)現(xiàn)這些菌可能通過肽聚糖合成系統(tǒng)、硫和脂質(zhì)代謝、囊多糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、細(xì)菌III型和IV型分泌系統(tǒng)、HSP90參與了BD的發(fā)生。并根據(jù)以上研究結(jié)果對(duì)腸道微生物影響B(tài)D發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了解釋。第三部分BD患者口腔微生物的研究目的:利用16s rRNA測序技術(shù)分析BD患者口腔微生物的組成和差異,以期明確口腔微生物是否參與了BD的發(fā)生,以及BD患者口腔微生物與腸道微生物之間的關(guān)系。方法:分別收集活動(dòng)期未用藥BD患者、正常人唾液。提取唾液DNA,PCR擴(kuò)增后采用Illumina MiSeq測序儀進(jìn)行16S rRNA測序。對(duì)16S rRNA測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果:產(chǎn)乳酸菌Bifidobacteriaceae,Coriobacteriaceae,Lactobacillaceae以及硫酸鹽還原菌Desulfovibrio為BD患者的富集菌,而Neisseriales為正常人的富集菌。結(jié)論:BD患者差異性口腔微生物與差異性腸道微生物具有一致性,與腸道微生物共同參與了BD的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R593.2
【部分圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文，活動(dòng)期未用藥 BD 病患者與活動(dòng)期已用藥 BD 病患者間腸道微生物存在 7 個(gè)性差異菌屬。提示活動(dòng)期未用藥 BD 患者與活動(dòng)期已用藥 BD 患者間腸道微生構(gòu)存在差異。3 物種 LEfSe 差異分析為了進(jìn)一步明確活動(dòng)期未用藥 BD 患者、活動(dòng)期已用藥 BD 患者和正常人之組間影響最顯著的腸道微生物群落或物種，研究組對(duì)組間分別進(jìn)行了物種 LE異分析。3.1 活動(dòng)期未用藥 BD 患者組與正常人組間腸道微生物 LEfSe 差異

在 屬 水 平 上 ， Phascolarctobacterium, Veillonella, Porphyromonas, LeptotrichiaCapnocytophaga, SR1_genera_incertae_sedis, Coprobacter, Lutispora, RothiaGranullcatella, Weissella, Sphingomonas, Lachonanaerobaculum 13 種菌屬為活動(dòng)期未用藥 BD 患者腸道微生物中影響最大的富集菌群。而 Roseburia, DialisteClostridium XVIII, Butyricicoccus 4 種菌屬為正常人組影響最大的富集菌群（圖1.1）。2.3.2 活動(dòng)期已用藥 BD 患者與正常人腸道微生物 LEfSe 差異對(duì)活動(dòng)期已用藥 BD 患者與正常人腸道微生物 LEfSe 差異，結(jié)果顯示在屬水平上，Phascolarctobacterium, Enterococcus, Fusicatenibacter, Weissella, ActinomyceTrichococcus 6種菌屬為活動(dòng)期已用藥BD患者腸道微生物中影響最大的富集菌群而 Ruminococcus, Parabacteroides, Odoribacter, Turicibacter 4 種菌屬為正常人組腸道微生物中影響最大的富集菌群（圖 1.2）。

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文3.3 活動(dòng)期未用藥 BD 患者與活動(dòng)期已用藥 BD 患者腸道微生物 LEfSe 差異我們進(jìn)一步對(duì)活動(dòng)期未用藥 BD 患者與活動(dòng)期已用藥 BD 患者腸道微生物fSe 分析。結(jié)果顯示在屬水平上，Bifidobacterium, Veillonella, Coprobacter, Roeptotrichia, Sphingomonadales, Capnocytophaga 7種菌屬為活動(dòng)期未用藥BD患道微生物中影響最大的富集菌群。Fusicatenibacter, Dialister, ClostridiumXtyricicoccus 4 種菌屬為活動(dòng)期已用藥 BD 患者腸道微生物中影響最大的富集(圖 1.3)。
【參考文獻(xiàn)】

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1 龔興國,于紅;熱休克蛋白60的研究進(jìn)展[J];中國病理生理雜志;2004年11期

本文編號(hào)：2857274