糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而導致的以高血糖為主要特征的代謝異常綜合征,隨著人口老年化的加劇以及人們生活方式的改變,中國糖尿病的發(fā)病率逐年上升,從而對家庭和社會帶來了沉重的負擔。糖尿病患者常見的慢性并發(fā)癥是糖尿病神經病變(diabetic neuropathy,DN)導致的神經病理性疼痛,大約有超過50%的成人糖尿病患者存在糖尿病神經病變。糖尿病神經病變患者經常會出現(xiàn)痛覺過敏或異常性疼痛,表現(xiàn)為對傷害性刺激的過度敏感,或者將正常刺激視為痛苦的刺激。然而目前有關糖尿病神經病變的神經生物學機制還未完全闡明,治愈糖尿病神經病變仍然面臨很大挑戰(zhàn)。前人的研究表明,脊髓背角對糖尿病神經病變痛感覺信號的感知至關重要。研究發(fā)現(xiàn)在炎癥或神經損傷后脊髓背角可能會出現(xiàn)中樞致敏,這可能導致糖尿病神經病變中原發(fā)性傳入和脊髓神經可塑性增加以及脊髓背角神經元過度活動。其中脊髓背角神經元活動過度的神經機制可能涉及N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體。一方面,注射NMDA誘導了神經結扎大鼠中脊髓L2椎間神經元的鈣內流增加的更加明顯;另一方面,NMDA受體的拮抗作用顯著降低了脊神經結扎的大鼠背角神經元的誘發(fā)反應。這種效應可能涉及NMDA受體的NR2B亞基,因為有大量研究證據(jù)表明脊髓NMDA受體的NR2B亞基在傷害性信號處理和病理性疼痛中發(fā)揮重要作用。目前研究糖尿病神經病變的大多數(shù)動物研究來自對嚙齒動物注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制備的動物模型,鏈脲佐菌素是一種胰腺β-細胞的細胞毒素,這種嚙齒類動物發(fā)展出類似于Ⅰ型糖尿病的綜合征。Ⅰ型糖尿病性神經病變與脊髓初級傳入末梢谷氨酸釋放增加有關。STZ誘導的糖尿病大鼠表現(xiàn)出觸覺異常性疼痛和痛覺過敏,并且這種觸覺異常性疼痛與NMDA受體中NR2B亞基在脊髓中的表達增加有關。然而,NMDA受體是否參與Ⅱ型糖尿病動物模型的糖尿病性神經病變尚不清楚。鑒于目前確診的成人糖尿病病例中90-95%是Ⅱ型糖尿病,而且動物研究也已證明在肥胖相關的前驅糖尿病動物中存在糖尿病性神經病變,因此研究NMDA受體在前驅糖尿病神經病變中的作用將至關重要。NMDA受體的功能受Src家族酪氨酸激酶的嚴格調控。在脊髓中,NR2A和NR2B是NMDA受體主要的亞基,而NR2B亞基在脊髓背角的淺表層有很高的表達。更重要的是,在中樞神經系統(tǒng)中NR2A和NR2B亞基都可以被酪氨酸激酶磷酸化。先前研究表明脊髓中含有NR2B的NMDA受體負責維持化學誘導的神經性疼痛,并且Fyn激酶在NR2B亞基Tyr1472處的磷酸化對于維持神經性疼痛是必需的。然而,很少有研究關注Fyn激酶在前驅糖尿病性神經病變中的作用。因此,本研究旨在研究Fyn介導的NMDA受體信號級聯(lián)反應在前驅糖尿病神經病變小鼠脊髓中的作用。第一部分NMDA受體NR2B亞基在小鼠前驅糖尿病神經病變中的作用實驗目的:檢測NMDA受體NR2B亞基在小鼠前驅糖尿病神經病變中的作用。實驗方法:1.實驗分組:成年雄性C57BL6/SV129小鼠隨機分為正常對照組和糖尿病組,每組各40只。高脂飲食誘發(fā)前驅糖尿病動物模型:糖尿病組小鼠用高脂肪飼料飼養(yǎng),對照組小鼠用正常飼料飼養(yǎng),均飼養(yǎng)16周或24周。在16和24周飼養(yǎng)結束后的第一周分別收集兩組小鼠的體重和血糖數(shù)據(jù)。2.行為學測試:所有行為測試均在16周或24周高脂飲食或者正常飲食結束后進行。每只小鼠接受兩次行為測試。通過von Frey針刺痛覺測試套件測定小鼠的觸覺反應。測量von Frey單絲的機械性退縮閾值來評價神經病變的進展,使用上下法確定50%的退縮閾值。在Von Frey檢測后的第二天,使用熱板測試來確定熱敏感性。3.檢測各組NR2B亞基的表達情況:收集16周或24周飲食處理后的小鼠的脊髓組織,通過Western blotting實驗分析脊髓中NR2B亞基的表達情況以及NR2B亞基在Tyr1472處的磷酸化的水平。NR2B活化指歸一化的pNR2B/總NR2B水平。4.抑制NR2B亞基后的行為學表現(xiàn):在小鼠脊髓的L5和L6之間的椎間隙,鞘內注射5μL對照溶劑(磷酸鹽緩沖鹽水中的1%DMSO)或Ro25-6981(含有選擇性NMDA受體NR2B亞基的拮抗劑)。注射五分鐘后,進行小鼠行為測試。實驗結果:1.高脂飲食對小鼠體重、血糖水平和食物攝入量的影響:第一周高脂飲食后,與正常飲食的小鼠相比,小鼠表現(xiàn)出輕微增加的體重和食物攝入量,但血糖水平并沒有增加。而16或24周的高脂飲食后小鼠體重、食物攝取量以及血糖水平相對于正常飲食對照小鼠都明顯增加。2.高脂飲食對小鼠觸覺異常性疼痛和熱痛覺過敏的影響:與正常飲食對照小鼠相比,16和24周高脂飲食導致小鼠出現(xiàn)觸覺異常性疼痛和熱痛覺過敏減退。此外,與高脂飲食16周相比,高脂飲食24周時小鼠的觸覺異常性疼痛和熱痛覺減退更加嚴重。3.高脂飲食對小鼠脊髓中NR2B亞基表達的影響:與正常飲食對照小鼠相比,高脂飲食小鼠脊髓中的NR2B亞基表達在16和24周時有所增加。此外,高脂飲食24周時NR2B亞基在脊髓中的表達相比高脂飲食16周時更強。NR2B亞基在Tyr1472處的磷酸化也表現(xiàn)出類似的變化,即NR2B的活化(p-NR2B與NR2B之比)增加。4.鞘內注射NMDA受體NR2B亞基的拮抗劑對小鼠行為學的影響:鞘內注射Ro 25-6981能夠緩解高脂飲食引起的觸覺異常性疼痛,但不影響熱痛覺消退。鞘內注射Ro 25-6981的量從5 μg增加到20 μg時,小鼠的縮爪閾值顯著增加。然而,鞘內注射Ro 25-6981的任一劑量都不會改變小鼠的舔爪潛伏期。實驗結論:NMDA受體NR2B亞基的表達和功能的增加有助于Ⅱ型糖尿病神經病變的發(fā)病進展。第二部分Fyn介導的NMDA受體信號級聯(lián)反應在小鼠前驅糖尿病神經病變中的作用實驗目的:檢測Fyn介導的NMDA受體信號級聯(lián)反應在小鼠前驅糖尿病神經病變中的作用。實驗方法:1.實驗分組:成年雄性Fyn野生型C57BL6/SV129小鼠和Fyn敲除(Fyn-/-)小鼠(C57BL6/SV129背景),隨機分為正常對照組和糖尿病組,每組各40只。糖尿病組用高脂肪飼料飼喂16周或24周。體重和血糖數(shù)據(jù)在高脂飲食處理16和24周后的第一周收集。2.行為學測試:所有行為測試均在16周或24周普通飲食或高脂飲食后進行。每只小鼠接受兩次行為測試。通過von Frey針刺痛覺測試套件測定小鼠的觸覺反應。測量von Frey單絲的機械性退縮閾值來評價神經病變的進展,使用上下法確定50%的退縮閾值。在Von Frey檢測后的第二天,使用熱板測試來確定熱敏感性。3.檢測各組Fyn激酶和NR2B亞基表達水平:收集16周或24周飲食處理后的小鼠的脊髓組織,通過Western blotting實驗分析脊髓中Fyn激酶和NR2B亞基以及NR2B亞基磷酸化的表達情況。4.檢測Fyn激酶和NR2B亞基之間的直接相互作用:對野生型小鼠的脊髓樣品和單克隆抗Fyn抗體免疫共沉淀,隨后通過抗NR2B抗體進行免疫印跡分析。實驗結果:1.高脂飲食對小鼠體重、血糖水平和食物攝入量變化:Fyn-/-小鼠和野生型小鼠在高脂飲食治療后,體重,血糖水平和食物攝入量變化相似。第一周高脂飲食后,與正常飲食的小鼠相比,Fyn-/-小鼠表現(xiàn)出輕微增加的體重和食物攝入量,但血糖水平并沒有增加。在16或24周的高脂飲食后,Fyn-/-小鼠表現(xiàn)出更明顯的體重增加。另外,與正常飲食對照小鼠相比,高脂飲食喂養(yǎng)組中的食物攝取顯著增加。此外,在16或24周的高脂飲食后,Fyn-/-小鼠的血糖水平相對于正常飲食對照小鼠有所增加。2.高脂飲食對小鼠觸覺異常性疼痛和熱痛覺過敏的影響:高脂飲食會導致Fyn-/-小鼠熱痛覺減退,但不會引起觸覺異常性疼痛。前驅糖尿病的Fyn-/-小鼠與正常飲食Fyn-/-小鼠比較,高脂肪飲食治療16和24周后,小鼠表現(xiàn)出熱痛覺減退,但沒有觸覺異常性疼痛。另外,與高脂飲食16周相比,高脂飲食24周時小鼠的熱痛覺減退更明顯。3.高脂飲食對小鼠脊髓中Fyn激酶表達的影響:高脂飲食未能改變野生型小鼠脊髓中Fyn激酶的表達。然而,與正常飲食喂養(yǎng)的小鼠相比,高脂飲食促進了野生型小鼠脊髓中Fyn激酶和NR2B亞基的相互作用,且這種相互作用在24周的高脂飲食中比16周時增強。4.高脂飲食對小鼠脊髓中NR2B亞基表達的影響:與正常飲食對照小鼠相比,16和24周的高脂飲食都增加了 Fyn-/-小鼠脊髓中NR2B亞基的表達,且24周時NR2B亞基表達增加更強。然而,高脂飲食并沒有改變Fyn-/-小鼠脊髓中NR2B的Tyr1472位點磷酸化水平。實驗結論:Fyn介導的NR2B受體信號轉導在調節(jié)前驅糖尿病性神經病變中起關鍵作用。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

疼痛狀況中的臨床效用的證據(jù)。??１．?ＮＭＤＡＲ沿疼痛途徑分布??傷害性信號從脊髓背角傳遞到大腦被稱為上行通路（圖１）。初級感覺神經??元（傷害感受器）的神經末梢檢測到有害刺激。感覺神經被賦予識別有害的熱，??化學或機械刺激的特定受體和通道。外周神經末梢的傷害性信號以動作電位的形??式沿軸突傳遞。初級感覺神經元的細胞體位于背根神經節(jié)（ＤＲＧ）和三叉神經節(jié)。??感覺神經元的中樞突終止于脊髓背角，在那里它們釋放興奮性神經遞質，如谷氨??酸和Ｐ物質［５４］（圖１）。??２６??

起的疼痛過敏反應的減輕［１２４，?１２５］，突出顯示了?ＮＭＤＡＲ磷酸化在慢性疼痛發(fā)展??中的關鍵作用。在本節(jié)中，我們回顧主要蛋白激酶和磷酸酶（如鈣調磷酸酶）在??慢性疼痛中的作用（圖２）。??Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ?ｔｅｒｍｉｎａｌｓ??ＪＬＩ?Ｉ?ＪＩＭ??Ｐｈｙｓｉｏｌｐｇｉｃａｌ?ｓｔｉｍｕｉｇｊ?Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ?ｐａｉｎ／?ｇｉｕＮ３??／?Ａ?ＩＮＭＤＡＲ?Ｉ?Ｗｍ?Ｖ??／?ｘ－—．?Ｇｌｕｔａｍａｔｅ?Ｘ??＾?ｖ?ＨＩ?／??Ｐ〇Ｓ＜５ｙｎａｐ？ｉｃ?ｄ＜？ｒ５９ｌ?Ｈｏｒｎ?ｎｃ？ｒ〇ｆ？５??圖２．調節(jié)神經性疼痛中的突觸＿ＡＲ活性的信號機制。在神經性疼痛中，增加??的突觸前ＮＭＤＡＲ活性促進谷氨酸從初級傳入神經末梢釋放，并增加神經元興奮性??和ＫＣＣ２的蛋白水解切割，進而影響突觸抑制。蛋白激酶（例如ＣＫ２，?ＣａＭＫＩＩ和??Ｓｒｃ）和磷酸酶（例如鈣調磷酸酶）通過調節(jié)ＮＭＤＡＲ和與其相互作用的蛋白的磷??酸化來控制ＮＭＤＡＲ活性。??鈣調磷酸酶（Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）和ＣＫ２?（前者磷酸酶，后者是激酶）分別對ＮＭＤＡＲ??３１??

圖２高脂飲食處理對ＮＲ２Ｂ水平及活化的影響（ｎ＝１０／組）。??對總ＮＲ２Ｂ水平（Ａ），ｐＮＲ２Ｂ對ＮＲ２Ｂ比率（Ｂ）進行蛋白質印跡分析。＊表??示與正常飲食對照有顯著性差異（Ｐ?＜〇．〇５）?；＃表示相對于１６周有顯著性差異（Ｐ＜０＿０５）。??３９??
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本文編號：2855308