糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而導(dǎo)致的以高血糖為主要特征的代謝異常綜合征,隨著人口老年化的加劇以及人們生活方式的改變,中國(guó)糖尿病的發(fā)病率逐年上升,從而對(duì)家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。糖尿病患者常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥是糖尿病神經(jīng)病變(diabetic neuropathy,DN)導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛,大約有超過(guò)50%的成人糖尿病患者存在糖尿病神經(jīng)病變。糖尿病神經(jīng)病變患者經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏或異常性疼痛,表現(xiàn)為對(duì)傷害性刺激的過(guò)度敏感,或者將正常刺激視為痛苦的刺激。然而目前有關(guān)糖尿病神經(jīng)病變的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制還未完全闡明,治愈糖尿病神經(jīng)病變?nèi)匀幻媾R很大挑戰(zhàn)。前人的研究表明,脊髓背角對(duì)糖尿病神經(jīng)病變痛感覺(jué)信號(hào)的感知至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)在炎癥或神經(jīng)損傷后脊髓背角可能會(huì)出現(xiàn)中樞致敏,這可能導(dǎo)致糖尿病神經(jīng)病變中原發(fā)性傳入和脊髓神經(jīng)可塑性增加以及脊髓背角神經(jīng)元過(guò)度活動(dòng)。其中脊髓背角神經(jīng)元活動(dòng)過(guò)度的神經(jīng)機(jī)制可能涉及N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體。一方面,注射N(xiāo)MDA誘導(dǎo)了神經(jīng)結(jié)扎大鼠中脊髓L2椎間神經(jīng)元的鈣內(nèi)流增加的更加明顯;另一方面,NMDA受體的拮抗作用顯著降低了脊神經(jīng)結(jié)扎的大鼠背角神經(jīng)元的誘發(fā)反應(yīng)。這種效應(yīng)可能涉及NMDA受體的NR2B亞基,因?yàn)橛写罅垦芯孔C據(jù)表明脊髓NMDA受體的NR2B亞基在傷害性信號(hào)處理和病理性疼痛中發(fā)揮重要作用。目前研究糖尿病神經(jīng)病變的大多數(shù)動(dòng)物研究來(lái)自對(duì)嚙齒動(dòng)物注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制備的動(dòng)物模型,鏈脲佐菌素是一種胰腺β-細(xì)胞的細(xì)胞毒素,這種嚙齒類(lèi)動(dòng)物發(fā)展出類(lèi)似于Ⅰ型糖尿病的綜合征。Ⅰ型糖尿病性神經(jīng)病變與脊髓初級(jí)傳入末梢谷氨酸釋放增加有關(guān)。STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠表現(xiàn)出觸覺(jué)異常性疼痛和痛覺(jué)過(guò)敏,并且這種觸覺(jué)異常性疼痛與NMDA受體中NR2B亞基在脊髓中的表達(dá)增加有關(guān)。然而,NMDA受體是否參與Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型的糖尿病性神經(jīng)病變尚不清楚。鑒于目前確診的成人糖尿病病例中90-95%是Ⅱ型糖尿病,而且動(dòng)物研究也已證明在肥胖相關(guān)的前驅(qū)糖尿病動(dòng)物中存在糖尿病性神經(jīng)病變,因此研究NMDA受體在前驅(qū)糖尿病神經(jīng)病變中的作用將至關(guān)重要。NMDA受體的功能受Src家族酪氨酸激酶的嚴(yán)格調(diào)控。在脊髓中,NR2A和NR2B是NMDA受體主要的亞基,而NR2B亞基在脊髓背角的淺表層有很高的表達(dá)。更重要的是,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NR2A和NR2B亞基都可以被酪氨酸激酶磷酸化。先前研究表明脊髓中含有NR2B的NMDA受體負(fù)責(zé)維持化學(xué)誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛,并且Fyn激酶在NR2B亞基Tyr1472處的磷酸化對(duì)于維持神經(jīng)性疼痛是必需的。然而,很少有研究關(guān)注Fyn激酶在前驅(qū)糖尿病性神經(jīng)病變中的作用。因此,本研究旨在研究Fyn介導(dǎo)的NMDA受體信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在前驅(qū)糖尿病神經(jīng)病變小鼠脊髓中的作用。第一部分NMDA受體NR2B亞基在小鼠前驅(qū)糖尿病神經(jīng)病變中的作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康?檢測(cè)NMDA受體NR2B亞基在小鼠前驅(qū)糖尿病神經(jīng)病變中的作用。實(shí)驗(yàn)方法:1.實(shí)驗(yàn)分組:成年雄性C57BL6/SV129小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和糖尿病組,每組各40只。高脂飲食誘發(fā)前驅(qū)糖尿病動(dòng)物模型:糖尿病組小鼠用高脂肪飼料飼養(yǎng),對(duì)照組小鼠用正常飼料飼養(yǎng),均飼養(yǎng)16周或24周。在16和24周飼養(yǎng)結(jié)束后的第一周分別收集兩組小鼠的體重和血糖數(shù)據(jù)。2.行為學(xué)測(cè)試:所有行為測(cè)試均在16周或24周高脂飲食或者正常飲食結(jié)束后進(jìn)行。每只小鼠接受兩次行為測(cè)試。通過(guò)von Frey針刺痛覺(jué)測(cè)試套件測(cè)定小鼠的觸覺(jué)反應(yīng)。測(cè)量von Frey單絲的機(jī)械性退縮閾值來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)病變的進(jìn)展,使用上下法確定50%的退縮閾值。在Von Frey檢測(cè)后的第二天,使用熱板測(cè)試來(lái)確定熱敏感性。3.檢測(cè)各組NR2B亞基的表達(dá)情況:收集16周或24周飲食處理后的小鼠的脊髓組織,通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)分析脊髓中NR2B亞基的表達(dá)情況以及NR2B亞基在Tyr1472處的磷酸化的水平。NR2B活化指歸一化的pNR2B/總NR2B水平。4.抑制NR2B亞基后的行為學(xué)表現(xiàn):在小鼠脊髓的L5和L6之間的椎間隙,鞘內(nèi)注射5μL對(duì)照溶劑(磷酸鹽緩沖鹽水中的1%DMSO)或Ro25-6981(含有選擇性NMDA受體NR2B亞基的拮抗劑)。注射五分鐘后,進(jìn)行小鼠行為測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.高脂飲食對(duì)小鼠體重、血糖水平和食物攝入量的影響:第一周高脂飲食后,與正常飲食的小鼠相比,小鼠表現(xiàn)出輕微增加的體重和食物攝入量,但血糖水平并沒(méi)有增加。而16或24周的高脂飲食后小鼠體重、食物攝取量以及血糖水平相對(duì)于正常飲食對(duì)照小鼠都明顯增加。2.高脂飲食對(duì)小鼠觸覺(jué)異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏的影響:與正常飲食對(duì)照小鼠相比,16和24周高脂飲食導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)觸覺(jué)異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏減退。此外,與高脂飲食16周相比,高脂飲食24周時(shí)小鼠的觸覺(jué)異常性疼痛和熱痛覺(jué)減退更加嚴(yán)重。3.高脂飲食對(duì)小鼠脊髓中NR2B亞基表達(dá)的影響:與正常飲食對(duì)照小鼠相比,高脂飲食小鼠脊髓中的NR2B亞基表達(dá)在16和24周時(shí)有所增加。此外,高脂飲食24周時(shí)NR2B亞基在脊髓中的表達(dá)相比高脂飲食16周時(shí)更強(qiáng)。NR2B亞基在Tyr1472處的磷酸化也表現(xiàn)出類(lèi)似的變化,即NR2B的活化(p-NR2B與NR2B之比)增加。4.鞘內(nèi)注射N(xiāo)MDA受體NR2B亞基的拮抗劑對(duì)小鼠行為學(xué)的影響:鞘內(nèi)注射Ro 25-6981能夠緩解高脂飲食引起的觸覺(jué)異常性疼痛,但不影響熱痛覺(jué)消退。鞘內(nèi)注射Ro 25-6981的量從5 μg增加到20 μg時(shí),小鼠的縮爪閾值顯著增加。然而,鞘內(nèi)注射Ro 25-6981的任一劑量都不會(huì)改變小鼠的舔爪潛伏期。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:NMDA受體NR2B亞基的表達(dá)和功能的增加有助于Ⅱ型糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病進(jìn)展。第二部分Fyn介導(dǎo)的NMDA受體信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在小鼠前驅(qū)糖尿病神經(jīng)病變中的作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康?檢測(cè)Fyn介導(dǎo)的NMDA受體信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在小鼠前驅(qū)糖尿病神經(jīng)病變中的作用。實(shí)驗(yàn)方法:1.實(shí)驗(yàn)分組:成年雄性Fyn野生型C57BL6/SV129小鼠和Fyn敲除(Fyn-/-)小鼠(C57BL6/SV129背景),隨機(jī)分為正常對(duì)照組和糖尿病組,每組各40只。糖尿病組用高脂肪飼料飼喂16周或24周。體重和血糖數(shù)據(jù)在高脂飲食處理16和24周后的第一周收集。2.行為學(xué)測(cè)試:所有行為測(cè)試均在16周或24周普通飲食或高脂飲食后進(jìn)行。每只小鼠接受兩次行為測(cè)試。通過(guò)von Frey針刺痛覺(jué)測(cè)試套件測(cè)定小鼠的觸覺(jué)反應(yīng)。測(cè)量von Frey單絲的機(jī)械性退縮閾值來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)病變的進(jìn)展,使用上下法確定50%的退縮閾值。在Von Frey檢測(cè)后的第二天,使用熱板測(cè)試來(lái)確定熱敏感性。3.檢測(cè)各組Fyn激酶和NR2B亞基表達(dá)水平:收集16周或24周飲食處理后的小鼠的脊髓組織,通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)分析脊髓中Fyn激酶和NR2B亞基以及NR2B亞基磷酸化的表達(dá)情況。4.檢測(cè)Fyn激酶和NR2B亞基之間的直接相互作用:對(duì)野生型小鼠的脊髓樣品和單克隆抗Fyn抗體免疫共沉淀,隨后通過(guò)抗NR2B抗體進(jìn)行免疫印跡分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.高脂飲食對(duì)小鼠體重、血糖水平和食物攝入量變化:Fyn-/-小鼠和野生型小鼠在高脂飲食治療后,體重,血糖水平和食物攝入量變化相似。第一周高脂飲食后,與正常飲食的小鼠相比,Fyn-/-小鼠表現(xiàn)出輕微增加的體重和食物攝入量,但血糖水平并沒(méi)有增加。在16或24周的高脂飲食后,Fyn-/-小鼠表現(xiàn)出更明顯的體重增加。另外,與正常飲食對(duì)照小鼠相比,高脂飲食喂養(yǎng)組中的食物攝取顯著增加。此外,在16或24周的高脂飲食后,Fyn-/-小鼠的血糖水平相對(duì)于正常飲食對(duì)照小鼠有所增加。2.高脂飲食對(duì)小鼠觸覺(jué)異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏的影響:高脂飲食會(huì)導(dǎo)致Fyn-/-小鼠熱痛覺(jué)減退,但不會(huì)引起觸覺(jué)異常性疼痛。前驅(qū)糖尿病的Fyn-/-小鼠與正常飲食Fyn-/-小鼠比較,高脂肪飲食治療16和24周后,小鼠表現(xiàn)出熱痛覺(jué)減退,但沒(méi)有觸覺(jué)異常性疼痛。另外,與高脂飲食16周相比,高脂飲食24周時(shí)小鼠的熱痛覺(jué)減退更明顯。3.高脂飲食對(duì)小鼠脊髓中Fyn激酶表達(dá)的影響:高脂飲食未能改變野生型小鼠脊髓中Fyn激酶的表達(dá)。然而,與正常飲食喂養(yǎng)的小鼠相比,高脂飲食促進(jìn)了野生型小鼠脊髓中Fyn激酶和NR2B亞基的相互作用,且這種相互作用在24周的高脂飲食中比16周時(shí)增強(qiáng)。4.高脂飲食對(duì)小鼠脊髓中NR2B亞基表達(dá)的影響:與正常飲食對(duì)照小鼠相比,16和24周的高脂飲食都增加了 Fyn-/-小鼠脊髓中NR2B亞基的表達(dá),且24周時(shí)NR2B亞基表達(dá)增加更強(qiáng)。然而,高脂飲食并沒(méi)有改變Fyn-/-小鼠脊髓中NR2B的Tyr1472位點(diǎn)磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:Fyn介導(dǎo)的NR2B受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)前驅(qū)糖尿病性神經(jīng)病變中起關(guān)鍵作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R587.2
【部分圖文】：

疼痛狀況中的臨床效用的證據(jù)。??１．?ＮＭＤＡＲ沿疼痛途徑分布??傷害性信號(hào)從脊髓背角傳遞到大腦被稱(chēng)為上行通路（圖１）。初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)??元（傷害感受器）的神經(jīng)末梢檢測(cè)到有害刺激。感覺(jué)神經(jīng)被賦予識(shí)別有害的熱，??化學(xué)或機(jī)械刺激的特定受體和通道。外周神經(jīng)末梢的傷害性信號(hào)以動(dòng)作電位的形??式沿軸突傳遞。初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的細(xì)胞體位于背根神經(jīng)節(jié)（ＤＲＧ）和三叉神經(jīng)節(jié)。??感覺(jué)神經(jīng)元的中樞突終止于脊髓背角，在那里它們釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨??酸和Ｐ物質(zhì)［５４］（圖１）。??２６??

起的疼痛過(guò)敏反應(yīng)的減輕［１２４，?１２５］，突出顯示了?ＮＭＤＡＲ磷酸化在慢性疼痛發(fā)展??中的關(guān)鍵作用。在本節(jié)中，我們回顧主要蛋白激酶和磷酸酶（如鈣調(diào)磷酸酶）在??慢性疼痛中的作用（圖２）。??Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ?ｔｅｒｍｉｎａｌｓ??ＪＬＩ?Ｉ?ＪＩＭ??Ｐｈｙｓｉｏｌｐｇｉｃａｌ?ｓｔｉｍｕｉｇｊ?Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ?ｐａｉｎ／?ｇｉｕＮ３??／?Ａ?ＩＮＭＤＡＲ?Ｉ?Ｗｍ?Ｖ??／?ｘ－—．?Ｇｌｕｔａｍａｔｅ?Ｘ??＾?ｖ?ＨＩ?／??Ｐ〇Ｓ＜５ｙｎａｐ？ｉｃ?ｄ＜？ｒ５９ｌ?Ｈｏｒｎ?ｎｃ？ｒ〇ｆ？５??圖２．調(diào)節(jié)神經(jīng)性疼痛中的突觸＿ＡＲ活性的信號(hào)機(jī)制。在神經(jīng)性疼痛中，增加??的突觸前ＮＭＤＡＲ活性促進(jìn)谷氨酸從初級(jí)傳入神經(jīng)末梢釋放，并增加神經(jīng)元興奮性??和ＫＣＣ２的蛋白水解切割，進(jìn)而影響突觸抑制。蛋白激酶（例如ＣＫ２，?ＣａＭＫＩＩ和??Ｓｒｃ）和磷酸酶（例如鈣調(diào)磷酸酶）通過(guò)調(diào)節(jié)ＮＭＤＡＲ和與其相互作用的蛋白的磷??酸化來(lái)控制ＮＭＤＡＲ活性。??鈣調(diào)磷酸酶（Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）和ＣＫ２?（前者磷酸酶，后者是激酶）分別對(duì)ＮＭＤＡＲ??３１??

圖２高脂飲食處理對(duì)ＮＲ２Ｂ水平及活化的影響（ｎ＝１０／組）。??對(duì)總ＮＲ２Ｂ水平（Ａ），ｐＮＲ２Ｂ對(duì)ＮＲ２Ｂ比率（Ｂ）進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。＊表??示與正常飲食對(duì)照有顯著性差異（Ｐ?＜〇．〇５）?；＃表示相對(duì)于１６周有顯著性差異（Ｐ＜０＿０５）。??３９??
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本文編號(hào)：2855308