目的:觀察番石榴葉總?cè)?TTPGL)對3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗(IR)的改善作用,并探討其可能的作用機(jī)制。方法:培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化,給予TTPGL(0.3、1、3、10μg/L),并設(shè)溶媒(0.1%DMSO)組、陽性藥正釩酸鈉(Van,10μmol/L)組、正常對照(control)組和模型(model)組,藥物作用48 h。MTT法檢測藥物對前脂肪細(xì)胞活力的影響,油紅O染色法觀察其對細(xì)胞分化的影響。建立IR模型后,藥物處理48 h,葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(GOD-POD)檢測IR脂肪細(xì)胞上清液中葡萄糖消耗量;比色法檢測游離脂肪酸(FFA)水平;ELISA法檢測脂肪因子分泌水平;real-time PCR檢測IR脂肪細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶1B(PTP1B)的mRNA表達(dá)量;Western blot檢測磷酸化胰島素受體底物1/胰島素受體底物1(p-IRS-1/IRS-1)和磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B(p-Akt/Akt)的蛋白水平。結(jié)果:與溶媒組比較,TTPGL顯著提高了前脂肪細(xì)胞的活力并抑制其分化(P0.01)。與IR溶媒組比較,無論在基礎(chǔ)狀態(tài)下還是胰島素刺激狀態(tài)下,TTPGL(1-10μg/L)均顯著地促進(jìn)了IR脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗(P0.01);TTPGL(0.3~3μg/L)顯著抑制FFA的產(chǎn)生(P0.01)。與模型組比較,TTPGL(0.3和3μg/L)顯著增加IR脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的分泌(P0.05)并抑制TNF-α的分泌(P0.01),TTPGL(3μg/L)對抵抗素的分泌有顯著抑制作用(P0.05),對瘦素分泌無顯著作用;TTPGL(3μg/L)顯著下調(diào)IR脂肪細(xì)胞PTP1B的mRNA表達(dá)(P0.01);TTPGL(3μg/L)極顯著上調(diào)p-IRS-1/IRS-1的水平;TTPGL(0.3和3μg/L)顯著上調(diào)p-Akt/Akt的蛋白水平(P0.05)。結(jié)論:TTPGL具有顯著改善3T3-L1脂肪細(xì)胞IR的作用,其作用機(jī)制可能與TTPGL下調(diào)了IR脂肪細(xì)胞PTP1B mRNA的表達(dá)、同時上調(diào)p-IRS-1/IRS-1和p-Akt/Akt的蛋白水平有關(guān)。
【部分圖文】：

課題采用3T3-L1脂肪細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，繼續(xù)探討TTPGL對3T3-L1脂肪細(xì)胞IR的改善作用，并通過觀察TTPGL對IR脂肪細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶1B(proteintyrosinephosphatase1B，PTP1B)的mRNA的表達(dá)以及對胰島素受體底物1(insulinreceptorsubstrate1IRS-1)、蛋白激酶B(proteinkinaseB，Akt)磷酸化的影響，揭示其改善胰島素抵抗的作用機(jī)制。材料和方法1材料1．1樣本與試劑3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和細(xì)胞資源中心;番石榴葉總?cè)朴婶吣洗髮W(xué)中藥與天然藥物化學(xué)研究所張曉琦教授提供，其分子結(jié)構(gòu)式見圖1;高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶均購自Gibco。MTT購自Amresco;地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、油紅O和DMSO購自Sigma;正釩酸鈉(sodiumorthovanadate，Van)購自阿拉丁公司;無水乙醇、異丙醇、多聚甲醛和冰乙酸購自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;TRIzol購自Invitrogen;DNA引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成;ReverTraAceqPCRRTKit和SsoFastEvaGreenSupermixqPCRKit購自TOYOBO;抗GAPDH、IRS-1、p-Akt(Ser473)和Akt的抗體購自CST;抗p-IRS-1(Tyr632)的抗體購自Abcam。Figure1．ChemicalstructuralformulaofTTPGL圖1番石榴葉總?cè)频幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式1．2主要儀器ELX800多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek);BR4i低溫高速離心機(jī)(Thermo);TS100倒置顯微鏡(Nikon);DK-S22電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);79-1磁力加熱攪拌器(北京六一儀器廠);HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司);PTC-1152PCR儀(Bio-Rad);SMYUV-750紫外分光光度計(上�？等A生化儀器制造廠);Trans-BlotTurbo蛋白電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad);ImageQuantLAS4000凝膠成像系統(tǒng)(GEHealthcare)。2方法2．13T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

Figure7．TheeffectsofTTPGLonthelevelofadipocytokinesinIRadipocytes．Mean±SD．n=6．▲▲P＜0.01vscontrolgroup;*P＜0.05，＊＊P＜0.01vsmodelgroup．#P＜0.05，##P＜0.01vsVangroup．圖7番石榴葉總?cè)茖σ葝u素抵抗脂肪細(xì)胞脂肪因子分泌的影響Figure8．TheeffectsofTTPGLonthemRNAexpressionofPTP1BinIRadipocytes．Mean±SD．n=6．＊＊P＜0.01vsmodelgroup．圖8番石榴葉總?cè)茖σ葝u素抵抗脂肪細(xì)胞PTP1BmR-NA表達(dá)的影響3μg/LTTPGL顯著增加了p-IRS-1/IRS-1的水平(P＜0.01);TTPGL(0.3和3μg/L)顯著增加p-Akt/Akt水平(P＜0.01)。TTPGL在3μg/L劑量下對p-IRS-1/IRS-1和p-Akt/Akt的影響與Van比較沒有顯著性差異。在0.3μg/L劑量下對p-Akt/Akt的作用明顯低于Van(P＜0.01)，見圖9。討論隨著人們生活水平的提高，肥胖人數(shù)比例逐年增加，糖尿病與之密切相關(guān)，在2型糖尿病人群中，75%的患者伴有肥胖［4］。有研究表明，當(dāng)肥胖患者通過調(diào)節(jié)飲食或運動有效的控制了體重，可以在一定程度上改善胰島素抵抗，減輕糖尿病癥狀［5］。除此之外，胰島素抵抗的機(jī)制還可能、糖毒性、脂毒性相關(guān)［6-7］，同時，胰島素的生物學(xué)效應(yīng)還受脂肪因子、PTP1B、PPARγ等多種因子的調(diào)節(jié)［8-9］。脂肪細(xì)胞分為兩種，未分化的前脂肪細(xì)胞又叫小脂肪細(xì)胞，分化成熟的脂肪細(xì)胞又叫大脂肪細(xì)胞，其中大脂肪細(xì)胞數(shù)量增多和體積增大對脂肪的積累和肥胖的發(fā)生起著重要作用［10］。本實驗采用3T3-L1前脂肪細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)并誘導(dǎo)其分化，在給予藥物干預(yù)后，觀察藥物對細(xì)胞的增殖及分化的影響。我們觀察到TTPGL對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，此時增加的是小脂肪細(xì)胞數(shù)量;在分化實驗中，TTPGL顯著抑制細(xì)胞分化的作用?

Figure9．TheeffectofTTPGLontherelativeproteinlevelsofp-IRS-1andp-AktinIRadipocytes．Mean±SD．n=6．＊＊P＜0.01vsmodelgroup;##P＜0.01vsVangroup．圖9番石榴葉總?cè)茖σ葝u素抵抗脂肪細(xì)胞p-IRS-1/IRS-1、p-Akt/Akt水平的影響糖毒性與脂毒性在IR過程中發(fā)揮重要作用，同時IR又會加重糖毒性與脂毒性，從而形成惡性循環(huán)［11-12］。在本實驗中，我們采用分化成熟的脂肪細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，給藥處理后，觀察藥物對IR脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響。本實驗發(fā)現(xiàn)，無論是在基礎(chǔ)狀態(tài)下還是胰島素刺激狀態(tài)下，TTPGL在較低劑量下顯著促進(jìn)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗并抑制FFA的產(chǎn)生，具有改善IR脂肪細(xì)胞糖脂代謝的作用。脂肪組織是一個巨大的內(nèi)分泌器官，它可以分泌多種脂肪因子從而實現(xiàn)對糖脂代謝、炎癥等生理活動的調(diào)節(jié)。這些脂肪因子在體內(nèi)增多或減少，對胰島素生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮有重要影響［13］。研究表明一些脂肪因子例如脂聯(lián)素等具有胰島素增敏劑的作用［14］;另外一些脂肪因子如TNF-α、抵抗素等可引起胰島素抵抗［15-16］;瘦素對胰島素抵抗具有雙向調(diào)節(jié)作用，在一定濃度下具有抑制食欲促進(jìn)糖脂代謝的作用，當(dāng)出現(xiàn)瘦素抵抗，瘦素水平升高并引起胰島素抵抗［17］。在脂肪因子分泌的實驗中，發(fā)現(xiàn)TTPGL顯著促進(jìn)了IR脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的分泌并抑制其TNF-α的分泌，在較高濃度下對抵抗素的分泌也有抑制作用，與陽性藥Van作用相似。通過以上實驗，我們發(fā)現(xiàn)TTGPL具有顯著改善3T3-L1胰島素抵抗脂肪細(xì)胞糖脂代謝以及脂肪因子分泌的作用，認(rèn)為其具有改善IR的作用，其作用與Van一致。Van作為PTP1B的抑制劑，通過抑制PTP1B而改善胰島素信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)胰島素與胰島素受體結(jié)合后主要通過IRS-1/PI3K/Akt信號
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本文編號：2850977