目的:研究Hippo信號(hào)通路下游效應(yīng)因子YAP/TAZ對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞遷移和侵襲的影響,并初步闡明干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)是否可能通過調(diào)控細(xì)胞自噬影響RA-FLS的遷移和侵襲。方法:1、選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RA-FLS,經(jīng)FITC標(biāo)記的鼠抗人CD90抗體和PE標(biāo)記的鼠抗人CD55抗體孵育后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。2、運(yùn)用 Western Blot 檢測(cè) RA-FLS(RA-FLS 組)和正常人 FLS(NC-FLS 組)中 YAP和TAZ的表達(dá)情況,并分析兩組的表達(dá)差異。3、構(gòu)建干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)的慢病毒載體,包裝慢病毒后感染細(xì)胞,進(jìn)一步使用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定干擾YAP表達(dá)(sh-YAP組)、穩(wěn)定干擾TAZ表達(dá)(sh-TAZ組)以及空載病毒對(duì)照組(sh-C組)的細(xì)胞模型,并采用RT-qPCR與Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證。4、利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)對(duì)RA-FLS遷移和侵襲的影響。5、通過Western Blot檢測(cè)干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)對(duì)RA-FLS中自噬相關(guān)蛋白LC3B和p62表達(dá)的影響。6、利用細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)研究干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)對(duì)RA-FLS中LC3B斑點(diǎn)形成的影響。7、運(yùn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察自噬抑制劑CQ、3-MA對(duì)干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)后RA-FLS遷移和侵襲的影響。8、通過Western Blot檢測(cè)自噬抑制劑CQ、3-MA對(duì)干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)后RA-FLS中LC3B和p62表達(dá)的影響。結(jié)果:流式細(xì)胞儀鑒定MH7A表達(dá)CD90和CD55的陽(yáng)性率為96.7±1.18%(n=3),明確該細(xì)胞株為RA-FLS,可用于后期實(shí)驗(yàn)。本課題首先采用Western Blot檢測(cè)RA-FLS和NC-FLS中YAP和TAZ的表達(dá),結(jié)果顯示,RA-FLS中YAP和TAZ的表達(dá)明顯升高,提示RA-FLS中YAP和TAZ呈現(xiàn)高表達(dá)。其次,構(gòu)建干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)的慢病毒載體,包裝慢病毒后感染細(xì)胞,進(jìn)一步使用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定干擾YAP表達(dá)(sh-YAP組)、穩(wěn)定干擾TAZ表達(dá)(sh-TAZ組)以及空載病毒對(duì)照組(sh-C組)的細(xì)胞模型,并采用RT-q與Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,sh-YAP組RA-FLS中的YAP和sh-TAZ組RA-FLS中TAZ分別在mRNA、蛋白水平上表達(dá)明顯降低。同時(shí),利用RT-qPCR檢測(cè)了目前公認(rèn)的受到Y(jié)AP/TAZ轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因CTGF和CYR61的mRNA水平,結(jié)果表明,sh-YAP組和sh-TAZ組RA-FLS中CTGF和CYR61的mRNA表達(dá)水平也顯著下降。結(jié)果提示,細(xì)胞模型構(gòu)建成功,可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。為了研究穩(wěn)定干擾YAP表達(dá)(sh-YAP組)和穩(wěn)定干擾TAZ表達(dá)(sh-TAZ組)對(duì)RA-FLS遷移和侵襲的影響,運(yùn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,sh-YAP組和sh-TAZ組劃痕愈合明顯減慢;Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,sh-YAP組和sh-TAZ組RA-FLS遷移的數(shù)目明顯減少,與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符;Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,sh-YAP組和sh-TAZ組RA-FLS侵襲的數(shù)目明顯減少。結(jié)果提示,干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)可抑制RA-FLS的遷移和侵襲。進(jìn)一步研究了穩(wěn)定干擾YAP表達(dá)(sh-YAP組)和穩(wěn)定干擾TAZ表達(dá)(sh-TAZ組)對(duì)RA-FLS自噬的影響,Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,sh-YAP組和sh-TAZ組RA-FLS中LC3B-Ⅱ的表達(dá)量明顯上升,而p62表達(dá)明顯下降。細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,sh-YAP組和sh-TAZ組RA-FLS中LC3B斑點(diǎn)形成增加。結(jié)果表明,干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)可促RA-FLS的自噬。為了闡明穩(wěn)定干擾YAP表達(dá)(sh-YAP組)和穩(wěn)定干擾TAZ表達(dá)(sh-TAZ組)對(duì)RA-遷移和侵襲的影響是否可能通過調(diào)控細(xì)胞自噬來(lái)實(shí)現(xiàn)的,進(jìn)一步探究了自噬抑制劑CQ、3-MA對(duì)sh-YAP組和sh-TAZ組RA-FLS的作用,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移和襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與sh-YAP組相比,sh-YAP+CQ組、sh-YAP+3-MA組RA-FLS遷移和侵襲明顯增強(qiáng);與sh-TAZ組相比,sh-TAZ+CQ組、sh-TAZ+3-MA組RA-FLS遷移和襲也明顯增強(qiáng)。Western Blot結(jié)果顯示,與sh-YAP組相比,sh-YAP+CQ組LC3B-Ⅱ、p62的表達(dá)明顯升高;與sh-TAZ組相比,sh-TAZ+CQ組LC3B-Ⅱ、p62的表達(dá)明顯升高。與sh-YAP組相比,sh-YAP+3-MA組LC3B-Ⅱ表達(dá)量稍下降,但p62的表達(dá)明顯升高。與sh-TAZ組相比,sh-TAZ+3-MA組LC3B-Ⅱ表達(dá)也稍下降,但p62的表達(dá)也明顯升高。果提示,抑制RA-FLS自噬可逆轉(zhuǎn)干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)對(duì)RA-FLS遷移和侵襲的響。結(jié)論:RA-FLS中的YAP和TAZ呈現(xiàn)高表達(dá),干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)可明顯抑制RA-的遷移和侵襲。同時(shí),干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)能夠促進(jìn)RA-FLS的自噬,抑制RA-FLS的自噬可逆轉(zhuǎn)干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)對(duì)RA-FLS遷移和侵襲的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,干擾YAP和干擾TAZ表達(dá)可能通過調(diào)控細(xì)胞自噬抑制RA-FLS的遷移和侵襲。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R593.22
【部分圖文】：

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ＲＡ－ＦＬＳ?（ＭＨ７Ａ），離心收集細(xì)胞后先以異硫氰酸熒光素??（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ?ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）標(biāo)記的?ＣＤ９０?抗體和藻紅蛋白（Ｐ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ＰＥ）??標(biāo)記的ＣＤ５５抗體標(biāo)記細(xì)胞，再通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)情況，如圖１??所示，細(xì)胞同時(shí)表達(dá)ＣＤ５５、ＣＤ９０的陽(yáng)性率為９６．７土?１．１８％?（ｎ＝３），結(jié)果表明此細(xì)胞為??ＲＡ－ＦＬＳ，可用于后期實(shí)驗(yàn)。??Ａ?＾?＾￣＂?０１－ＵＲ?？?＾?０１－ＵＲ??ｒ：???ｉ＾ｏ；?＾ｉ：?ｉ?－〇；?—??：〇１－ＬＬ＊＇＊?．?：?Ｑ１－ＬＬ??—Ｉ?１１?ＩＲＩ｜?Ｉ?Ｉ?Ｉ?ｌｌｉｎｆ?■?ｉ?１１?ｉ“ｉ｜?ｉ?ｉ?１１?Ｉ?Ｉ?ｔｉｉｍ｜?ｉ?ｉ?ｕｌｉｉｉｊ?Ｉ?＾?ｌｌｌｉｆｔ｜?ｉ??１０？?１〇４?１Ｃｆ?１０？?１〇Ｐ?１０４?１０？??ＣＤ５Ｓ?ＰＥ－Ａ?ＣＤ５５?ＰＥ－Ａ??圖１?ＲＡ－ＦＬＳ的鑒定結(jié)果，Ａ為不加抗體的陰性對(duì)照，Ｂ為表達(dá)ＣＤ５５＋／ＣＤ９０＋的細(xì)胞群??Ｆｉｇ．?１?Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ＲＡ－ＦＬＳ，?Ａ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ?ｉｎｃｕｂａｔｅｄ?ｗｉｔｈｏｕｔ?ａｎｔｉｂｏｄｙｓ，?Ｂ??ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｇｒｏｕｐ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ?ＣＤ５５＋／ＣＤ９０＋??３．２?ＲＡ－ＦＬＳ中的ＹＡＰ和ＴＡＺ表達(dá)升髙??本課題前期工作結(jié)合基因芯片技術(shù)和ＲＴ－ｑＰＣＲ驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常人ＦＬＳ（ＮＣ－ＦＬＳ??組）相比

ＲＡ－ＦＬＳ?（ＲＡ－ＦＬＳ組）中ＹＡＰ和ＴＡＺ的表達(dá)升高。為進(jìn)一步明確ＹＡＰ和ＴＡＺ??蛋白水平的表達(dá)情況，我們提取ＮＣ－ＦＬＳ組和ＲＡ－ＦＬＳ組細(xì)胞的總蛋白，運(yùn)用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ??檢測(cè)兩組細(xì)胞中ＹＡＰ、ＴＡＺ的表達(dá)情況，結(jié)果如圖２所示：與ＮＣ－ＦＬＳ組相比，ＲＡ－ＦＬＳ??組細(xì)胞中ＹＡＰ和ＴＡＺ在蛋白水平上的表達(dá)也明顯升高（Ｐ＜〇．〇５）。??

建、慢病毒包裝、慢病毒感染細(xì)胞及嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞等一系列過程，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定干擾??ＹＡＰ和ＴＡＺ表達(dá)細(xì)胞模型的構(gòu)建，并采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞模型中綠色熒光蛋白的表??達(dá)，圖３－Ａ中，上圖為光鏡下所見的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，下圖為熒光顯微鏡下相同視野，在??空載對(duì)照組（ｓｈ－Ｃ組）、干擾ＹＡＰ表達(dá)組（ｓｈ－ＹＡＰ組）、干擾ＴＡＺ表達(dá)組（ｓｈ－ＴＡＺ組）??中綠色熒光蛋白均明顯表達(dá)，表明慢病毒能夠感染ＲＡ－ＦＬＳ。然后，為了進(jìn)一步分析ＲＡ－ＦＬＳ??中ＹＡＰ、ＴＡＺ基因的干擾情況，運(yùn)用ＲＴ－ｑＰＣＲ檢測(cè)各組ＲＡ－ＦＬＳ中ＹＡＰ、ＴＡＺ的ｍＲＮＡ??表達(dá)水平，結(jié)果如圖３－Ｂ所示：與空白對(duì)照組（ＮＣ組）、ｓｈ－Ｃ組相比，ｓｈ－ＹＡＰ組細(xì)胞中??ＹＡＰ的ｍＲＮＡ表達(dá)明顯下降（Ｐ＜０．０５?），?ｓｈ－ＴＡＺ組細(xì)胞中ＴＡＺ的ｍＲＮＡ表達(dá)明顯下降??（尸＜０．０５），表明在慢病毒載體感染ＲＡ－ＦＬＳ后，可以分別干擾ＹＡＰ和干擾ＴＡＺｍｌＷＡ??水平的表達(dá)。同時(shí)，為了研宄各組ＲＡ－ＦＬＳ中ＹＡＰ和ＴＡＺ蛋白水平的表達(dá)，我們提取各??組ＲＡ－ＦＬＳ的總蛋白，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖３－Ｃ所示：與ＮＣ組、ｓｈ－Ｃ??組相比
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