類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見自身免疫性疾病。RA在成年人中發(fā)病率約為0.5%-1%,年新發(fā)病例5-50例/10萬人。RA具有一定遺傳傾向,遺傳可能性為40-65%。RA臨床表現(xiàn)主要是多發(fā)性、對稱性的關(guān)節(jié)腫痛、攣縮畸形和功能障礙。除此之外,RA常伴發(fā)多臟器系統(tǒng)性病變,對患者生命健康和生活質(zhì)量有較大威脅。上世紀九十年代后期,研究人員在RA患者血清樣本中發(fā)現(xiàn)一類新型自身抗體-抗瓜氨酸蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibodies,ACPA)。研究發(fā)現(xiàn),該類抗體具有較好RA臨床診斷特異性。ACPA的靶抗原是一類發(fā)生蛋白翻譯后修飾(蛋白瓜氨酸化)而產(chǎn)生的瓜氨酸化抗原。通常,蛋白瓜氨酸化由肽精氨酸脫亞胺酶(peptidylarginine deiminase,PAD)催化實現(xiàn)。初步研究表明,ACPA可加劇RA慢性炎癥的持續(xù)具有顯著的致病作用。ACPA通過刺激單核巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α等促炎細胞因子,促進炎性進展。ACPA可協(xié)同類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)加重炎癥過程。白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)是在先天性免疫應(yīng)答過程中的關(guān)鍵炎癥介質(zhì),并在慢性炎癥病理進展中有重要作用。IL-1β在RA患者關(guān)節(jié)滑膜局部聚積,且在RA病情進展的各個階段均明顯升高。IL-1β主要通過炎性小體依賴的途徑產(chǎn)生。炎性小體主要由炎性小體傳感器分子(如NOD樣受體(NOD-like receptor,NLR)家族蛋白3(NLRP3)和NOD樣受體家族蛋白C4(NLRC4)等),銜接蛋白即凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)以及胱天蛋白酶1(Caspase 1)組成。在RA研究最常見的類型是NLRP3炎性小體。NLRP3炎性小體在RA中高度表達;RA患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中NLRP3炎性小體相關(guān)基因(ASC,NLRP3-FL,NLRP3-SL和CASP1基因)表達升高。此外,作為RA發(fā)病重要危險因素,非受體型酪氨酸蛋白磷酸酶22(tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 22,PTPN 22)可對NLRP3炎性小體活化進行調(diào)節(jié)。然而,RA患者體內(nèi)ACPA是否能刺激單核巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β目前尚無深入研究。本研究主要分三部分進行。第一部分:ACPA活化巨噬細胞NLRP3炎性小體誘導(dǎo)IL-1β產(chǎn)生。通過對ACPA陽性RA患者,ACPA陰性RA患者和骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)患者關(guān)節(jié)滑膜組織免疫組化染色(immunohistochemical staining,IHC staining)發(fā)現(xiàn),ACPA陽性RA組患者IL-1β水平升高。為對該現(xiàn)象在離體水平進行研究,我們使用患者血清純化的ACPA直接刺激PBMC來源的巨噬細胞并檢測培養(yǎng)基中的IL-1β水平。結(jié)果表明,ACPA刺激巨噬細胞以時間和劑量依賴性方式產(chǎn)生IL-1β。進一步研究發(fā)現(xiàn),干涉NLRP3分子IL-1β產(chǎn)生減少。該結(jié)果表明,ACPA通過活化巨噬細胞NLRP3炎性小體促進IL-1β產(chǎn)生。通過對RA患者滑膜組織中CD147和NLRP3表達水平分析,我們發(fā)現(xiàn)在ACPA陽性RA患者中NLRP3和CD147表達均增加且二者表達程度高度正相關(guān)。體外實驗表明,ACPA刺激慢病毒干涉CD147的巨噬細胞IL-1β產(chǎn)生顯著減少。與對照細胞相比,干涉CD147的巨噬細胞在ACPA刺激后Akt和NF-κB信號通路活化水平下降,而JNK信號通路活化水平未發(fā)生明顯變化。上述結(jié)果表明,ACPA在體內(nèi)和體外均可活化巨噬細胞NLRP3炎性小體誘導(dǎo)IL-1β炎性因子產(chǎn)生;CD147可能參與ACPA對巨噬細胞的活化過程。第二部分:ACPA增強CD147-integrinβ1相互作用,活化下游Akt/NF-κB信號通路。免疫熒光染色實驗結(jié)果表明CD147和ACPA在細胞表面共定位。Co-IP實驗和SPR實驗結(jié)果提示CD147和ACPA可發(fā)生相互作用。應(yīng)用Co-IP實驗進一步研究證實ACPA可增強CD147-integrinβ1相互作用。應(yīng)用GRGDS阻斷CD147-integrinβ1相互作用導(dǎo)致ACPA引起的Akt信號通路活化及pro-IL-1β表達受抑制。應(yīng)用LY294002抑制Akt信號通路也可得到類似結(jié)果,即NLRP3炎性小體表達減少,IL-1β產(chǎn)生減少。該現(xiàn)象表明,ACPA促進CD147-integrinβ1相互作用,并活化下游Akt信號通路,誘導(dǎo)NLRP3炎性小體相關(guān)成分表達。免疫熒光定量分析和Western blot實驗進一步證實ACPA引起的CD147-integrinβ1相互作用激活A(yù)kt信號通路后,導(dǎo)致下游NF-κB信號通路活化,并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子p65進入細胞核,促進NLRP3分子和pro-IL-1β分子轉(zhuǎn)錄。上述結(jié)果表明,ACPA可作為誘導(dǎo)劑促進NLRP3炎性小體的表達,為后續(xù)激活過程做準備。第三部分:ACPA誘導(dǎo)巨噬細胞釋放ATP促進NLRP3炎性小體激活。應(yīng)用ACPA處理PBMC來源的巨噬細胞,并應(yīng)用螢光素酶法對細胞培養(yǎng)液中ATP水平進行檢測,結(jié)果表明ACPA處理使PBMC來源的巨噬細胞培養(yǎng)液中ATP含量升高。干涉CD147或干涉integrinβ1或使用GRGDS阻斷二者相互作用均可顯著抑制細胞培養(yǎng)液中ATP含量升高。使用丙磺舒抑制Pannexin通道,可明顯抑制胞外ATP含量升高和IL-1β的產(chǎn)生。結(jié)果提示,胞外ATP含量升高可能是ACPA活化巨噬細胞Pannexin通道引起胞內(nèi)ATP外流所致。應(yīng)用oxATP阻斷胞外ATP與細胞膜表面P2X7受體結(jié)合或應(yīng)用格列本脲阻斷P2X7受體后,胞外ATP仍維持較高水平但IL-1β的產(chǎn)生明顯減少。該結(jié)果證明,胞外ATP活化NLRP3炎性小體需要P2X7受體參與。上述結(jié)果表明,ACPA可通過增強CD147-integrinβ1相互作用而激活Pannexin通道,促進ATP外排;ATP外排至細胞外后與細胞膜表面P2X7受體結(jié)合導(dǎo)致細胞內(nèi)NLRP3炎性小體激活。綜上所述,我們首次發(fā)現(xiàn)ACPA促進NLRP3炎性小體表達與活化,引起RA患者關(guān)節(jié)局部IL-1β增加。ACPA處理可增強巨噬細胞CD147-integrinβ1相互作用,激活下游Akt/NF-κB信號通路使NLRP3炎性小體成分表達增加。此外,ACPA激活巨噬細胞Pannexin通道,引起ATP外排。外排至細胞外的ATP與細胞膜表面P2X7受體結(jié)合,最終引起NLRP3炎性小體活化。本研究提出了RA中ACPA促進IL-1β產(chǎn)生的機制,明確ACPA在疾病發(fā)生中的新作用,提供了RA治療潛在的新靶點。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R593.22

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本文編號：2847094