背景:成骨前體細(xì)胞3T3-E1細(xì)胞來源于新生小鼠顱骨、長(zhǎng)干骨的細(xì)胞系,經(jīng)過培養(yǎng)后可觀察到肉眼可見的礦化結(jié)節(jié),其中MC3T3亞克隆4和14培養(yǎng)后可形成礦化良好的細(xì)胞外基質(zhì),可證明3T3-E1細(xì)胞具有體外誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞的能力,是研究體外成骨細(xì)胞分化的經(jīng)典模型。目前3T3-E1細(xì)胞被大量用作探討成骨細(xì)胞分化相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,曾有應(yīng)用降糖藥物、降低氧化應(yīng)激藥物及中藥等對(duì)該細(xì)胞影響的研究,而調(diào)脂藥物、雌激素受體調(diào)節(jié)劑相關(guān)的研究較少。目的:觀察阿托伐他汀鈣、雷洛昔芬對(duì)成骨前體細(xì)胞(3T3-E1)的增殖分化的作用,并比較兩者對(duì)3T3-E1細(xì)胞增殖與分化的影響。方法:1.顯微鏡下觀察成骨前體細(xì)胞3T3-E1形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)狀態(tài)。2.3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,設(shè)置對(duì)照組(不加入阿托伐他汀鈣),實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度阿托伐他鈣(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,24小時(shí)后利用CCK-8比色法觀察阿托伐他汀鈣對(duì)成骨前體細(xì)胞3T3-E1增殖能力的影響,測(cè)定吸光度值;繼續(xù)取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨前體細(xì)胞3T3-E1,設(shè)置對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的雷洛昔芬(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)處理培養(yǎng)成骨前體細(xì)胞3T3-E1,24小時(shí)后使用CCK8試劑盒檢測(cè)成骨前體細(xì)胞3T3-E1的增殖情況。3.3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,設(shè)置對(duì)照組(不加入阿托伐他汀鈣),實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度阿托伐他鈣(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,24小時(shí)后利用堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活力,測(cè)定吸光度值;同樣取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨前體細(xì)胞3T3-E1,分組同2,同樣于24小時(shí)后使用堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒測(cè)定ALP的活力,了解成骨前體細(xì)胞3T3-E1的分化情況。4.向3T3-E1細(xì)胞中加入對(duì)細(xì)胞增殖及分化作用最明顯的10-6mol/L阿托伐他汀鈣,干預(yù)細(xì)胞24小時(shí)后,用Trizol法提取細(xì)胞樣本中總RNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路標(biāo)志性基因PERK、Bip、eIF2α的mRNA表達(dá)水平;同樣選取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-E1成骨前體細(xì)胞,加入對(duì)細(xì)胞增殖及分化作用最強(qiáng)的10-7mol/L雷洛昔芬,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組,于24小時(shí)提取RNA,應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PERK、Bip、eIF2α的mRNA的表達(dá)情況。5.3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,設(shè)置對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組分別加入對(duì)3T3-E1細(xì)胞增殖與分化能力最強(qiáng)的10-6mol/L阿托伐他汀鈣、10-7mol/L雷洛昔芬的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,24小時(shí)后利用CCK-8比色法測(cè)定成骨前體細(xì)胞3T3-E1的吸光度值;3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,設(shè)置對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組分別加入對(duì)3T3-E1細(xì)胞增殖與分化能力最強(qiáng)的10-6mol/L阿托伐他汀鈣、l0-7mol/L雷洛昔芬的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,24小時(shí)后利用堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活力;3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,設(shè)置對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組分別加入對(duì)3T3-E1細(xì)胞增殖與分化能力最強(qiáng)的10-6mol/L阿托伐他汀鈣、10-7mol/L雷洛昔芬的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,24小時(shí)后應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PERK、Bip、eIF2α的mRNA的表達(dá)情況。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,各組間比較應(yīng)用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的3T3-E1細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)狀態(tài),呈現(xiàn)梭形、多角形及不規(guī)則形等形態(tài),細(xì)胞有的伸出突起,具備成骨細(xì)胞系生長(zhǎng)特性。2.不同濃度的阿托伐他汀鈣(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)均可促進(jìn)3T3-E1細(xì)胞增殖(P0.05),在一定濃度范圍內(nèi)隨著阿托伐他汀鈣干預(yù)濃度的增加,細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P0.05),以阿托伐他汀鈣(10-6mol/L)影響最顯著;加入雷洛昔芬藥物組與只加入培養(yǎng)液的空白對(duì)照組相比較,加入雷洛昔芬藥物組可以促進(jìn)成骨前體細(xì)胞3T3-E1的增殖(P0.05),在一定濃度范圍內(nèi)雷洛昔芬濃度增高,細(xì)胞增殖程度隨之升高(P0.05),雷洛昔芬(10-7mol/l)促增殖能力最強(qiáng)。3.不同濃度的阿托伐他汀鈣(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)干預(yù)細(xì)胞后,各組的ALP活性均增加,且以阿托伐他汀鈣(10-6mol/L)升高ALP活性最明顯(P0.05);加入藥物雷洛昔芬組與空白對(duì)照組相比較,加入雷洛昔芬藥物不同濃度處理后各組ALP活力均有所增加(P0.05),而且隨雷洛昔芬不同濃度的變化而變化,并且雷洛昔芬組(10-7mol/l)升高ALP的活力較明顯。4.終濃度10-6mol/L的阿托伐他汀鈣干預(yù)3T3-E1細(xì)胞24小時(shí),RT-PCR結(jié)果顯示,3T3-E1 細(xì)胞 Bip、PERK、eIF2α基因 mRNA 表達(dá)均高于對(duì)照組(P0.05);10-7mol/L 的雷洛昔芬雷洛昔芬處理后的成骨前體細(xì)胞3T3-E1測(cè)定Bip、PERK、eIF2α的表達(dá)均升高(P0.05)。5.10-6mol/L阿托伐他汀鈣與10-7mol/l雷洛昔芬干預(yù)3T3-E1細(xì)胞24小時(shí),兩組細(xì)胞OD值均較對(duì)照組升高,但兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6.阿托伐他汀鈣、雷洛昔芬最適濃度干預(yù)3T3-E1細(xì)胞,與對(duì)照組相比,堿性磷酸酶明顯升高,且阿托伐他汀鈣較雷洛昔芬對(duì)3T3-E1分化的促進(jìn)作用更顯著(P0.05)。7.阿托伐他汀鈣、雷洛昔芬最適濃度干預(yù)3T3-E1細(xì)胞,與對(duì)照組相比,Bip、PERK、eIF2α mRNA表達(dá)水平均升高(P0.05),實(shí)驗(yàn)組間比較,阿托伐他汀鈣組Bip、PERK表達(dá)更明顯(P0.05),而eIF2αmRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1.顯微鏡下觀察雷洛昔芬作用于成骨前體細(xì)胞3T3-E1,其形態(tài)符合成骨細(xì)胞系的生長(zhǎng)特征。2.阿托伐他汀鈣和雷洛昔芬能夠促進(jìn)成骨前體細(xì)胞(3T3-E1)的增殖,并且在一定范圍內(nèi)隨著濃度的升高,促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力愈明顯。3.阿托伐他汀鈣和雷洛昔芬能夠增加成骨前體細(xì)胞(3T3-E1)的成骨活性能力,在一定濃度范圍內(nèi),高濃度組的成骨活性能力高于相對(duì)低濃度組。4.mRNA水平,阿托伐他汀鈣、雷洛昔芬能夠上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路標(biāo)志性基因PERK、Bip、eIF2α的表達(dá),提示其促進(jìn)3T3-E1細(xì)胞增殖分化的作用機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路相關(guān)。5.阿托伐他汀鈣及雷洛昔芬最適濃度對(duì)3T3-E1細(xì)胞增殖效果無明顯差異,而阿托伐他汀鈣對(duì)成骨活性及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物基因的表達(dá)影響優(yōu)于雷洛昔芬。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

復(fù)蘇細(xì)胞并培養(yǎng)２４小時(shí)之后在顯微鏡下呈現(xiàn)分散的貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，顯微??鏡下形態(tài)近似為梭形、多角形等，胞質(zhì)豐富，胞核較大，胞漿內(nèi)能觀察到黑色顆粒，細(xì)??胞兩端伸出突起，具備成骨細(xì)胞系生長(zhǎng)特性。加入阿托伐他汀鈣之后３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞的數(shù)量??及密度明顯增加（圖３．１．１）。??

２．１顯微鏡下觀察成骨前體細(xì)胞３Ｔ３－Ｅ１及雷洛昔芬干預(yù)后的形態(tài)??加入完全培養(yǎng)基對(duì)照組與加入雷洛音芬藥物實(shí)驗(yàn)組相比較，加入藥物后成骨前體??細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)更明顯，且數(shù)量及密度較加入雷洛昔芬藥物之前明顯增加（圖３．２．１）。??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2838702