糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病。目前對(duì)于糖尿病狀態(tài)下骨代謝紊亂的機(jī)制尚未明確。研究高糖環(huán)境對(duì)于不同細(xì)胞成骨分化的影響機(jī)制對(duì)其臨床應(yīng)用有重要的意義。有研究表明,糖尿病患者的骨代謝異常也可能與炎癥環(huán)境有關(guān)。IL-10是一種強(qiáng)效抗炎細(xì)胞因子,研究其對(duì)于成骨分化的影響也具有重要意義。而高糖和IL-10如何調(diào)控成骨分化目前尚不清楚,而微環(huán)境的改變?nèi)绾斡绊懗晒欠只^(guò)程中的表觀遺傳修飾也尚不清楚,研究高糖環(huán)境對(duì)于成骨分化的影響及其調(diào)控的機(jī)制和表觀遺傳表達(dá)有重要的意義。目的:研究高糖環(huán)境對(duì)成骨分化的影響及相關(guān)信號(hào)通路和表觀遺傳變化方法:第一部分:高糖環(huán)境對(duì)成骨前體細(xì)胞及脂肪干細(xì)胞成骨分化的影響分離培養(yǎng)小鼠成骨前體細(xì)胞(MPC)、棕色脂肪干細(xì)胞(B-ASCs)、白色脂肪干細(xì)胞(W-ASCs),復(fù)蘇MC3T3-E1細(xì)胞系,分別給予不同濃度葡萄糖(5.5mmol/L、25mmol/L和55mmol/L)刺激,成骨誘導(dǎo)分化后采用堿性磷酸酶(ALP)染色觀察不同細(xì)胞成骨分化程度。取成骨前體細(xì)胞分別成骨誘導(dǎo)分化,采用qPCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)水平。采用Western blot檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。第二部分:高糖環(huán)境對(duì)IL-10低表達(dá)導(dǎo)致的成骨抑制的作用分離培養(yǎng)WT MPC和IL-10tml/tmlMPC,分別給予不同濃度葡萄糖(5.5mmol/L、25mmol/L和55mmol/L)刺激,成骨誘導(dǎo)分化7d,采用堿性磷酸酶(ALP)染色觀察不同細(xì)胞成骨分化程度,采用定量PCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因表達(dá)水平。取WT小鼠和IL-10tml/tml小鼠顱骨組織,采用microCT及定量PCR分析顱骨發(fā)育差異。第三部分:高糖環(huán)境通過(guò)STAT3通路調(diào)節(jié)細(xì)胞成骨分化過(guò)程并影響表觀遺傳相關(guān)蛋白的表達(dá)給予WTMPC不同濃度葡萄糖(5.5mmol/L、25mmol/L和55mmol/L)刺激,成骨誘導(dǎo)分化7d,采用Western Blot檢測(cè)成骨通路相關(guān)蛋白和表觀遺傳相關(guān)蛋白的表達(dá)。分別給與WT MPC和IL-10tml/tml MPC 25mmol/L葡萄糖刺激,成骨誘導(dǎo)分化7d,采用Western Blot檢測(cè)成骨通路相關(guān)蛋白和表觀遺傳相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:第一部分:高糖環(huán)境對(duì)成骨前體細(xì)胞及脂肪干細(xì)胞成骨分化的影響1.MC3T3-E1、MPC和W-ASCs的成骨分化能力隨著糖濃度的升高而升高,而B-ASCs的成骨分化能力則受到抑制。2.高糖促進(jìn)了 MPC的成骨分化能力,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3d和7d后,隨著糖濃度的升高,成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)也隨之升高。第二部分:高糖環(huán)境對(duì)IL-10低表達(dá)導(dǎo)致的成骨抑制的作用3.相較于WTMPC,IL-10 tml/tml MPC體外成骨分化能力明顯下降。4.相較于WT小鼠,IL-10tmltml小鼠的顱骨骨質(zhì)更為疏松,顱骨組織成骨相關(guān)基因表達(dá)更低。5.在IL-10tml/tmlMPC誘導(dǎo)過(guò)程中補(bǔ)充25mmol/L葡萄糖,可以部分回復(fù)其成骨分化能力。第三部分:高糖環(huán)境通過(guò)STAT3通路調(diào)節(jié)細(xì)胞成骨分化過(guò)程并影響表觀遺傳相關(guān)蛋白的表達(dá)1.隨著葡萄糖濃度升高,MPC的p-STAT3的表達(dá)被抑制,而STAT3總表達(dá)量無(wú)明顯差異,H3K4me3和H3K9ac的表達(dá)升高,而H3K27me3的表達(dá)降低。2.IL-10低表達(dá)后p-STAT3和STAT3明顯被激活。3.補(bǔ)充 25mmol/L 葡萄糖后,WT MPC 和 IL-10 tml/tml MPC 的 p-STAT3 表達(dá)明顯降低,H3K4me3和H3K9ac的表達(dá)升高,而H3K27me3的表達(dá)降低。結(jié)論:高糖環(huán)境對(duì)于不同細(xì)胞成骨分化的影響不同。高糖促進(jìn)成骨前體細(xì)胞的成骨分化,并且可以一定程度上挽救IL-10低表達(dá)后的成骨抑制作用。高糖環(huán)境抑制p-STAT3表達(dá),并通過(guò)STAT3通路促進(jìn)MPC成骨分化。IL-10低表達(dá)后激活p-STAT3的表達(dá),說(shuō)明IL-10通過(guò)STAT3通路調(diào)控細(xì)胞成骨分化進(jìn)程。高糖影響了成骨前體細(xì)胞成骨分化過(guò)程中表觀遺傳修飾蛋白的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

圖１成骨前體細(xì)胞系和原代成骨前體細(xì)胞培養(yǎng)Ｏｄ和７ｄ后的ＡＬＰ染色（５Ｘ）??Ｆｉｇ．?１．?ＡＬＰ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｏｆ?ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１?和?ＭＰＣ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｆｏｒ?０?ａｎｄ?７?ｄａｙｓ?（５Ｘ）??２．脂肪干細(xì)胞的表型鑒定和多向分化能力鑒定??本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)了白色脂肪干細(xì)胞（Ｗ－ＡＳＣｓ）和棕色脂肪干細(xì)胞（Ｂ－ＡＳＣｓ），并??通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其干細(xì)胞特性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，提取的Ｂ－ＡＳＣｓ和Ｗ－ＡＳＣｓ??均表現(xiàn)為Ｓｃａ－１、ＣＤ２９陽(yáng)性，ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ８６和ＭＨＣＩＩ陰性，符合文獻(xiàn)對(duì)脂??肪干細(xì)胞表型的報(bào)道［２７，２８］（圖２Ａ）。??Ｗ－ＡＳＣｓ和Ｂ－ＡＳＣｓ均具有成骨和成脂分化能力，提示其具有干細(xì)胞的多向分化??潛力（圖２Ｂ、Ｃ）。??

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其干細(xì)胞特性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，提取的Ｂ－ＡＳＣｓ和Ｗ－ＡＳＣｓ??均表現(xiàn)為Ｓｃａ－１、ＣＤ２９陽(yáng)性，ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ８６和ＭＨＣＩＩ陰性，符合文獻(xiàn)對(duì)脂??肪干細(xì)胞表型的報(bào)道［２７，２８］（圖２Ａ）。??Ｗ－ＡＳＣｓ和Ｂ－ＡＳＣｓ均具有成骨和成脂分化能力，提示其具有干細(xì)胞的多向分化??潛力（圖２Ｂ、Ｃ）。??２１??

?解放軍醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文???３．髙糖環(huán)境促進(jìn)成骨前體細(xì)胞的成骨分化??本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同葡萄糖濃度環(huán)境下成骨前體細(xì)胞系ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１和原代分離的??成骨前體細(xì)胞（ＭＰＣ）的成骨分化能力。??ＡＬＰ染色結(jié)果顯示，隨著葡萄糖濃度的升高，成骨前體細(xì)胞系ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１和成??骨前體細(xì)胞（ＭＰＣ）著色程度更深、著色斑點(diǎn)數(shù)量更多，提示成骨分化能力有所提高，??而不同糖濃度刺激原代分離的成骨前體細(xì)胞ＭＰＣ后組間成骨分化能力差異更加明顯??（圖?３）。??５．５?２５?５５???
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本文編號(hào)：2835802