目的:觀察經信號素3A(semaphorin 3A,Sema3A)處理后,2型糖尿病(T2DM)大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖、遷移及成骨分化能力是否發(fā)生變化。通過構建動物實驗模型,探究Sema3A刺激的BMSCs膜片對2型糖尿病大鼠新骨形成的作用。方法:通過高脂高糖持續(xù)飼養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素構建T2DM大鼠模型,分離和培養(yǎng)其BMSCs;采用RT-qPCR,Western blot比較正常及T2DM大鼠來源的BMSCs細胞Sema3A的表達特性;分別用0μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml Sema3A重組蛋白刺激BMSCs,CCK-8細胞增殖實驗、Transwell細胞遷移實驗檢測其增殖以及遷移能力的改變,RT-qPCR檢測成骨相關基因包括堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅰ型膠原(typeⅠcollagen alpha 1 chain,COLⅠ)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein,BMP2)、Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor-2,RUNX2)和骨鈣蛋白(Osteocalcin,Ocn)的表達;ALP染色、天狼星紅染色、茜素紅染色觀察BMSCs成骨分化能力、膠原形成能力和礦化水平的變化。誘導培養(yǎng)2型糖尿病大鼠BMSCs為細胞膜片,使用隨機數(shù)字表法將構建成模的2型糖尿病大鼠隨機分為對照組、膜片組、Sema3A膜片組(每組5只),建立大鼠顱骨極限骨缺損模型,對照組植入Bio-Oss?骨粉,膜片組植入BMSC膜片和骨粉,Sema3A膜片組植入1.0 mg/L Sema3A預處理的BMSC膜片和骨粉,8周后取材分別行顯微CT掃描及HE染色,比較三組BV/TV、Tb.Th及新骨形成比值分析新骨形成情況。結果:2型糖尿病大鼠骨髓間充質干細胞中Sema3A的表達顯著低于同齡健康大鼠。使用CCK8、Transwell檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度Sema3A對BMSCs增殖以及遷移能力無明顯影響。誘導3天時成骨相關基因ALP、COL1、BMP2、RUNX2和OCN的mRNA水平均顯著增加,7天時RUNX2,BMP和OCN的mRNA水平有所下降,而ALP和COL1與第3天相比進一步增加。ALP染色、天狼星紅以及茜素紅染色結果顯示,隨著Sema3A濃度升高,ALP活性、膠原分泌能力以及礦化結節(jié)生成顯著增加。3組2型糖尿病大鼠顱骨缺損區(qū)愈合情況的比較:顯微CT顯示,相比對照組和膜片組,Sema3A膜片組8周時新骨形成最多。Sema3A膜片組骨體積分數(shù)(BV/TV)(0.516±0.070)顯著大于膜片組(0.319±0.050)(p0.05),膜片組BV/TV顯著大于對照組(0.224±0.037)(p0.05)。而三組骨小梁厚度(Tb.Th)差異無統(tǒng)計學意義(p0.05),分別為(0.078±0.037)、(0.043±0.016)和(0.061±0.025)。HE染色分析可見,8周時膜片組新骨形成占缺損區(qū)域的比值為(0.174±0.051),顯著大于對照組(0.099±0.033)(p0.05),Sema3A膜片組新骨形成比值(0.421±0.069)顯著大于膜片組(p0.05)。結論:正常大鼠BMSCs中的Sema3A表達高于2型糖尿病大鼠的BMSCs,Sema3A可促進2型糖尿病大鼠BMSCs成骨相關基因的表達,促進2型糖尿病大鼠BMSCs的成骨分化。體內實驗表明,聯(lián)合植入骨粉和Sema3A刺激骨髓間充質干細胞膜片,可顯著提高大鼠骨再生能力。因此,通過Sema3A預處理的骨髓間充質干細胞膜片移植,為提高2型糖尿病患者骨再生能力提供了新的治療途徑。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1;R783
【部分圖文】：

圖 1 建模成功的 2 型糖尿病大鼠與正常大鼠比較圖 2 2 型糖尿病大鼠骨髓間充質干細胞（BMSC）的培養(yǎng)與鑒定 A：光學顯微鏡下見 BMSC 呈星形、多角形；B：成骨誘導 14 d 后茜素紅染色顯示紅色的礦化結節(jié)；成脂誘導 14 d 后油紅 O 染色顯示紅色的脂滴

圖 1 建模成功的 2 型糖尿病大鼠與正常大鼠比較圖 2 2 型糖尿病大鼠骨髓間充質干細胞（BMSC）的培養(yǎng)與鑒定 A：光學顯微鏡下可見 BMSC 呈星形、多角形；B：成骨誘導 14 d 后茜素紅染色顯示紅色的礦化結節(jié)；C成脂誘導 14 d 后油紅 O 染色顯示紅色的脂滴圖 3A 正常組 BMSCs 流式細胞術檢測結果

BMSC-N與BMSC-DRT-qPCR及Westernblot檢測

【參考文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 方開秀;Semaphorin 3A的促成骨分化作用在2型糖尿病大鼠種植體骨結合中的應用研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

本文編號：2824806