骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis)是骨代謝失衡引起的系統(tǒng)性骨骼疾病,影響數(shù)億人的健康。骨代謝平衡由執(zhí)行骨吸收功能的破骨細(xì)胞和執(zhí)行骨生成功能的成骨細(xì)胞共同維持。因此,研究影響破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化及功能的調(diào)節(jié)因素是認(rèn)識骨質(zhì)疏松發(fā)病機理的關(guān)鍵,并為骨質(zhì)疏松提供潛在的治療靶點。表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA序列的前提下,通過某些機制引起可遺傳的基因表達(dá)或細(xì)胞表型的變化。有證據(jù)表明表觀遺傳因素調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化,但組蛋白翻譯后修飾在破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化中的作用還沒有得到深入的研究。本課題前期利用質(zhì)譜篩選破骨細(xì)胞分化前后組蛋白翻譯后修飾的改變,發(fā)現(xiàn)H3K79me在破骨細(xì)胞分化后水平上升,并且DOT1L表達(dá)量上調(diào)。體外細(xì)胞實驗表明,利用小分子抑制劑抑制DOT1L的酶活性,或利用shRNA干擾DOT1L表達(dá)都能促進破骨細(xì)胞分化和骨吸收能力。小鼠體內(nèi)實驗顯示,DOT1L抑制劑處理后能夠加重卵巢摘除小鼠股骨和脛骨的骨丟失,并且增強骨頭中破骨細(xì)胞活性。此外,體內(nèi)和體外實驗均表明,DOT1L不影響成骨細(xì)胞分化和鈣結(jié)生成。為了明確DOT1L如何調(diào)控破骨細(xì)胞分化,RANKL誘導(dǎo)RAW264.7分化作為破骨細(xì)胞分化模型,定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于定量檢測DOT1L抑制劑EPZ5676處理后破骨細(xì)胞中的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果表明DOT1L主要調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞早期分化階段,并主要調(diào)節(jié)線粒體蛋白、自噬相關(guān)蛋白和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白。這些差異蛋白與細(xì)胞中活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生、自噬活性和細(xì)胞遷移能力密切相關(guān)。進一步實驗表明DOT1L抑制劑EPZ5676能夠增加細(xì)胞中ROS水平、上調(diào)破骨細(xì)胞自噬活性、增強破骨細(xì)胞遷移能力。其中,ROS是DOT1L調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子,介導(dǎo)DOT1L對破骨細(xì)胞自噬和細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)。此外,DOT1L抑制后還引起其他增強破骨細(xì)胞分化和骨吸收的因素改變,例如,破骨細(xì)胞中細(xì)胞融合蛋白CD9和骨吸收蛋白MMP9表達(dá)增強,破骨細(xì)胞分化中的重要轉(zhuǎn)錄因子NFATc1和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性增加。綜合以上研究結(jié)果,本課題發(fā)現(xiàn)DOT1L調(diào)節(jié)的、H3K79me介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)節(jié)調(diào)控破骨細(xì)胞分化,參與骨質(zhì)疏松發(fā)病,提示DOT1L以及DOT1L調(diào)節(jié)的蛋白網(wǎng)絡(luò)可以作為治療骨質(zhì)疏松的潛在靶點。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

并收集未誘導(dǎo)的ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞，破骨細(xì)胞（ＴＲＡＰ陽性的多核細(xì)胞）和前破骨細(xì)胞逡逑（ＴＲＡＰ陽性的單核細(xì)胞）。為了篩查組蛋白翻譯后修飾在破骨細(xì)胞分化中的變化，逡逑本課題利用酸抽提法富集收集三種細(xì)胞中的組蛋白，并進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離（圖１）。逡逑ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離完成后，切膠分離組蛋白Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３和Ｈ４，邋Ｔｒｙｐｓｉｎ酶解蛋白后，逡逑萃取純化出多肽，ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ檢測多肽信號。結(jié)果表明，以Ｈ３Ｋ７９ｍｅＯ為參照，組逡逑蛋白Ｈ３賴氨酸第７９位一甲基化（Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ）水平在破骨細(xì)胞分化中上調(diào)（圖２）。逡逑Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ／Ｈ３Ｋ７９ｍｅ０信號比值由分化前的１：１０變?yōu)榉只蟮模保海�。這說明，相對于逡逑未分化狀態(tài)，Ｈ３Ｋ７９ｍｌ的甲基化水平在分化后上調(diào)了大約３倍。逡逑為了驗證質(zhì)譜結(jié)果，同時檢測實驗結(jié)果的可靠性，再次使用同樣的誘導(dǎo)方法，逡逑獲得ＲＡＷ２６４．７、前破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，ＲＩＰＡ裂解細(xì)胞獲得全細(xì)胞裂解液。Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑Ｂｌｏｔ檢測Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ和Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２的水平變化，結(jié)果顯示，相對于ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞，逡逑前破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中Ｈ３Ｋ：７９ｍｅ２的水平顯著升高

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離完成后，切膠分離組蛋白Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３和Ｈ４，邋Ｔｒｙｐｓｉｎ酶解蛋白后，逡逑萃取純化出多肽，ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ檢測多肽信號。結(jié)果表明，以Ｈ３Ｋ７９ｍｅＯ為參照，組逡逑蛋白Ｈ３賴氨酸第７９位一甲基化（Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ）水平在破骨細(xì)胞分化中上調(diào)（圖２）。逡逑Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ／Ｈ３Ｋ７９ｍｅ０信號比值由分化前的１：１０變?yōu)榉只蟮模保海场＿@說明，相對于逡逑未分化狀態(tài)，Ｈ３Ｋ７９ｍｌ的甲基化水平在分化后上調(diào)了大約３倍。逡逑為了驗證質(zhì)譜結(jié)果，同時檢測實驗結(jié)果的可靠性，再次使用同樣的誘導(dǎo)方法，逡逑獲得ＲＡＷ２６４．７、前破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，ＲＩＰＡ裂解細(xì)胞獲得全細(xì)胞裂解液。Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑Ｂｌｏｔ檢測Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ和Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２的水平變化，結(jié)果顯示，相對于ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞，逡逑前破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中Ｈ３Ｋ：７９ｍｅ２的水平顯著升高，Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ的略有上調(diào)（圖２）。逡逑這一結(jié)果驗證了質(zhì)譜數(shù)據(jù)，證實了在破骨細(xì)胞分化中Ｈ３Ｋ７９ｍｅ水平上升。逡逑根據(jù)文獻報道

ＥＰＺ００４７７７劑量為１０邋）＿ｉＭ，２０邋ｐＭ和５０邋（ｉＭ時顯著抑制破骨細(xì)胞生成，表現(xiàn)為逡逑破骨細(xì)胞生成數(shù)量減少，細(xì)胞面積變小。并且，細(xì)胞面積隨ＥＰＺ００４７７７的濃度增大逡逑而減�。▓D３）。逡逑ａ邐邐ＥＰＺ００４７７７邐逡逑ＤＭＳＯ邐１邋ｌ＿ｉＭ邐１０邋ｊ．ｉＭ邐２０邋ｌｉＭ邐５０逡逑？邋ｔ”＇邐？．，知．ｖ逡逑／ｒ邋Ｙ邐＊４－＊逡逑二？邋。逡逑ｂ邐ｃ逡逑ｉｔ邋４０１邐＾邋４0ｎ逡逑｜邐§，邐ｔ邋＊邐－邋ＤＭＳＯ逡逑Ｓ邋３0－邋－ｒ邐－邋３０．邋丁邐Ｔ邐■邋ＥＰＺ００４７７７邋１邋ｌｉＭ逡逑￥邋N丁邐Ｓ邐Ｉ邐ｍ邋ＥＰＺ００４７７７邋１０邋ＭＭ逡逑Ｆ２０．邋■邋ｔ邋＊＊邋Ｔ邋？２0－邋Ａ邐＊＊＊邐ＥＰＺ００４７７７邋２０邋ｍＭ逡逑§邐■邐＇邐＾邐％邐■邐＿邋丁邐■邋ＥＰＺ００４７７７邋５０邋ｍＭ逡逑ｄ邐0邐ｓ邋１邐ｅ邐ｏ邐５？逡逑＾邐１邋ｔ邋ｏ邐＾邋ｆ邋＾邋ｏ逡逑ｋＤａ邐ｋＤａ邋0邋＾邐２邐２逡逑１５－邋ｍｍ邋ｍａｍ邋—邐Ｈ３Ｋ７９ｍｅ１邋１５￣邋ｍｍ邋ｍｍ邋ｍｍ邋—邋Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２逡逑１０—邐—Ｈ４邐１０—邐Ｈ４逡逑圖３：邋１％邋ＦＢＳ培養(yǎng)條件下ＤＯＴ１Ｌ抑制劑ＥＰＺ００４７７７對破骨細(xì)胞分化作用的影響。ＲＡＷ２６４．７逡逑培養(yǎng)在含有１％邋ＦＢＳ的ｏｔ－ＭＥＭ中，細(xì)胞鋪板密度為１．５ｘｌ0５邋Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，在３０邋ｎｇ／ｍＬ邋ＲＡＮＫＬ刺逡逑激下誘導(dǎo)成為破骨細(xì)胞。不同濃度的ＥＰＺ００４７７７加入含有ＲＡＮＫＬ的培養(yǎng)基中，檢測其對破骨逡逑細(xì)胞分化的影響。ａ

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本文編號：2822404