骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis)是骨代謝失衡引起的系統(tǒng)性骨骼疾病,影響數(shù)億人的健康。骨代謝平衡由執(zhí)行骨吸收功能的破骨細(xì)胞和執(zhí)行骨生成功能的成骨細(xì)胞共同維持。因此,研究影響破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化及功能的調(diào)節(jié)因素是認(rèn)識(shí)骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵,并為骨質(zhì)疏松提供潛在的治療靶點(diǎn)。表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA序列的前提下,通過(guò)某些機(jī)制引起可遺傳的基因表達(dá)或細(xì)胞表型的變化。有證據(jù)表明表觀遺傳因素調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化,但組蛋白翻譯后修飾在破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化中的作用還沒(méi)有得到深入的研究。本課題前期利用質(zhì)譜篩選破骨細(xì)胞分化前后組蛋白翻譯后修飾的改變,發(fā)現(xiàn)H3K79me在破骨細(xì)胞分化后水平上升,并且DOT1L表達(dá)量上調(diào)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,利用小分子抑制劑抑制DOT1L的酶活性,或利用shRNA干擾DOT1L表達(dá)都能促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和骨吸收能力。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,DOT1L抑制劑處理后能夠加重卵巢摘除小鼠股骨和脛骨的骨丟失,并且增強(qiáng)骨頭中破骨細(xì)胞活性。此外,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明,DOT1L不影響成骨細(xì)胞分化和鈣結(jié)生成。為了明確DOT1L如何調(diào)控破骨細(xì)胞分化,RANKL誘導(dǎo)RAW264.7分化作為破骨細(xì)胞分化模型,定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于定量檢測(cè)DOT1L抑制劑EPZ5676處理后破骨細(xì)胞中的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果表明DOT1L主要調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞早期分化階段,并主要調(diào)節(jié)線粒體蛋白、自噬相關(guān)蛋白和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白。這些差異蛋白與細(xì)胞中活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生、自噬活性和細(xì)胞遷移能力密切相關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明DOT1L抑制劑EPZ5676能夠增加細(xì)胞中ROS水平、上調(diào)破骨細(xì)胞自噬活性、增強(qiáng)破骨細(xì)胞遷移能力。其中,ROS是DOT1L調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子,介導(dǎo)DOT1L對(duì)破骨細(xì)胞自噬和細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)。此外,DOT1L抑制后還引起其他增強(qiáng)破骨細(xì)胞分化和骨吸收的因素改變,例如,破骨細(xì)胞中細(xì)胞融合蛋白CD9和骨吸收蛋白MMP9表達(dá)增強(qiáng),破骨細(xì)胞分化中的重要轉(zhuǎn)錄因子NFATc1和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性增加。綜合以上研究結(jié)果,本課題發(fā)現(xiàn)DOT1L調(diào)節(jié)的、H3K79me介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)節(jié)調(diào)控破骨細(xì)胞分化,參與骨質(zhì)疏松發(fā)病,提示DOT1L以及DOT1L調(diào)節(jié)的蛋白網(wǎng)絡(luò)可以作為治療骨質(zhì)疏松的潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

并收集未誘導(dǎo)的ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞，破骨細(xì)胞（ＴＲＡＰ陽(yáng)性的多核細(xì)胞）和前破骨細(xì)胞逡逑（ＴＲＡＰ陽(yáng)性的單核細(xì)胞）。為了篩查組蛋白翻譯后修飾在破骨細(xì)胞分化中的變化，逡逑本課題利用酸抽提法富集收集三種細(xì)胞中的組蛋白，并進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離（圖１）。逡逑ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離完成后，切膠分離組蛋白Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３和Ｈ４，邋Ｔｒｙｐｓｉｎ酶解蛋白后，逡逑萃取純化出多肽，ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ檢測(cè)多肽信號(hào)。結(jié)果表明，以Ｈ３Ｋ７９ｍｅＯ為參照，組逡逑蛋白Ｈ３賴氨酸第７９位一甲基化（Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ）水平在破骨細(xì)胞分化中上調(diào)（圖２）。逡逑Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ／Ｈ３Ｋ７９ｍｅ０信號(hào)比值由分化前的１：１０變?yōu)榉只蟮模保海�。這說(shuō)明，相對(duì)于逡逑未分化狀態(tài)，Ｈ３Ｋ７９ｍｌ的甲基化水平在分化后上調(diào)了大約３倍。逡逑為了驗(yàn)證質(zhì)譜結(jié)果，同時(shí)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，再次使用同樣的誘導(dǎo)方法，逡逑獲得ＲＡＷ２６４．７、前破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，ＲＩＰＡ裂解細(xì)胞獲得全細(xì)胞裂解液。Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑Ｂｌｏｔ檢測(cè)Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ和Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２的水平變化，結(jié)果顯示，相對(duì)于ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞，逡逑前破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中Ｈ３Ｋ：７９ｍｅ２的水平顯著升高

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離完成后，切膠分離組蛋白Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３和Ｈ４，邋Ｔｒｙｐｓｉｎ酶解蛋白后，逡逑萃取純化出多肽，ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ檢測(cè)多肽信號(hào)。結(jié)果表明，以Ｈ３Ｋ７９ｍｅＯ為參照，組逡逑蛋白Ｈ３賴氨酸第７９位一甲基化（Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ）水平在破骨細(xì)胞分化中上調(diào)（圖２）。逡逑Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ／Ｈ３Ｋ７９ｍｅ０信號(hào)比值由分化前的１：１０變?yōu)榉只蟮模保海�。這說(shuō)明，相對(duì)于逡逑未分化狀態(tài)，Ｈ３Ｋ７９ｍｌ的甲基化水平在分化后上調(diào)了大約３倍。逡逑為了驗(yàn)證質(zhì)譜結(jié)果，同時(shí)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，再次使用同樣的誘導(dǎo)方法，逡逑獲得ＲＡＷ２６４．７、前破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，ＲＩＰＡ裂解細(xì)胞獲得全細(xì)胞裂解液。Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑Ｂｌｏｔ檢測(cè)Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ和Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２的水平變化，結(jié)果顯示，相對(duì)于ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞，逡逑前破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中Ｈ３Ｋ：７９ｍｅ２的水平顯著升高，Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ的略有上調(diào)（圖２）。逡逑這一結(jié)果驗(yàn)證了質(zhì)譜數(shù)據(jù)，證實(shí)了在破骨細(xì)胞分化中Ｈ３Ｋ７９ｍｅ水平上升。逡逑根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道

ＥＰＺ００４７７７劑量為１０邋）＿ｉＭ，２０邋ｐＭ和５０邋（ｉＭ時(shí)顯著抑制破骨細(xì)胞生成，表現(xiàn)為逡逑破骨細(xì)胞生成數(shù)量減少，細(xì)胞面積變小。并且，細(xì)胞面積隨ＥＰＺ００４７７７的濃度增大逡逑而減�。▓D３）。逡逑ａ邐邐ＥＰＺ００４７７７邐逡逑ＤＭＳＯ邐１邋ｌ＿ｉＭ邐１０邋ｊ．ｉＭ邐２０邋ｌｉＭ邐５０逡逑？邋ｔ”＇邐？．，知．ｖ逡逑／ｒ邋Ｙ邐＊４－＊逡逑二？邋。逡逑ｂ邐ｃ逡逑ｉｔ邋４０１邐＾邋４0ｎ逡逑｜邐§，邐ｔ邋＊邐－邋ＤＭＳＯ逡逑Ｓ邋３0－邋－ｒ邐－邋３０．邋丁邐Ｔ邐■邋ＥＰＺ００４７７７邋１邋ｌｉＭ逡逑￥邋N丁邐Ｓ邐Ｉ邐ｍ邋ＥＰＺ００４７７７邋１０邋ＭＭ逡逑Ｆ２０．邋■邋ｔ邋＊＊邋Ｔ邋？２0－邋Ａ邐＊＊＊邐ＥＰＺ００４７７７邋２０邋ｍＭ逡逑§邐■邐＇邐＾邐％邐■邐＿邋丁邐■邋ＥＰＺ００４７７７邋５０邋ｍＭ逡逑ｄ邐0邐ｓ邋１邐ｅ邐ｏ邐５？逡逑＾邐１邋ｔ邋ｏ邐＾邋ｆ邋＾邋ｏ逡逑ｋＤａ邐ｋＤａ邋0邋＾邐２邐２逡逑１５－邋ｍｍ邋ｍａｍ邋—邐Ｈ３Ｋ７９ｍｅ１邋１５￣邋ｍｍ邋ｍｍ邋ｍｍ邋—邋Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２逡逑１０—邐—Ｈ４邐１０—邐Ｈ４逡逑圖３：邋１％邋ＦＢＳ培養(yǎng)條件下ＤＯＴ１Ｌ抑制劑ＥＰＺ００４７７７對(duì)破骨細(xì)胞分化作用的影響。ＲＡＷ２６４．７逡逑培養(yǎng)在含有１％邋ＦＢＳ的ｏｔ－ＭＥＭ中，細(xì)胞鋪板密度為１．５ｘｌ0５邋Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，在３０邋ｎｇ／ｍＬ邋ＲＡＮＫＬ刺逡逑激下誘導(dǎo)成為破骨細(xì)胞。不同濃度的ＥＰＺ００４７７７加入含有ＲＡＮＫＬ的培養(yǎng)基中，檢測(cè)其對(duì)破骨逡逑細(xì)胞分化的影響。ａ

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 江燕;;補(bǔ)充雌激素講究“剛剛好”[J];家庭科技;2017年03期

2 江燕;;補(bǔ)充雌激素講究“剛剛好”[J];益壽寶典;2017年01期

3 劉欣;楊美子;喬珍;綦才輝;金勇君;;黑皮質(zhì)素受體在破骨細(xì)胞形成中的作用[J];中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志;2012年07期

4 孫超;邱勇;;巨噬細(xì)胞集落刺激因子在破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)中的作用[J];中國(guó)骨與關(guān)節(jié)外科;2010年04期

5 張功學(xué);方淑玲;王萬(wàn)林;丁凱;熊寒涵;齊峰;詹義鳳;姚志平;;伴破骨細(xì)胞樣巨細(xì)胞的乳腺癌一例[J];中外醫(yī)療;2009年36期

6 王珂;李然偉;王秀巖;楊世杰;;表皮生長(zhǎng)因子受體對(duì)小鼠初級(jí)軟骨內(nèi)骨化、破骨細(xì)胞的募集及生成的影響[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年03期

7 劉俊棟;顧建紅;劉海霞;王健;劉宗平;;鴨破骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2007年11期

8 葉美君,廖世華,王凡;影響破骨細(xì)胞功能的主要因素[J];四川解剖學(xué)雜志;2004年01期

9 劉波,于世鳳;關(guān)于破骨細(xì)胞來(lái)源的幾種學(xué)說(shuō)[J];中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志;2004年01期

10 遲志永,韓綱,王巖;破骨細(xì)胞的局部調(diào)節(jié)機(jī)制[J];中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志;2004年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 劉程林;李淑娜;季葆華;霍波;;流體刺激對(duì)于破骨細(xì)胞遷移影響及機(jī)制研究[A];第十一屆全國(guó)生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第十三屆全國(guó)生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議論文摘要匯編[C];2015年

2 董世武;竇策;許建中;;破骨細(xì)胞融合的調(diào)控機(jī)制研究[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2015年年會(huì)論文文摘匯編[C];2015年

3 吳培福;鐘代彬;韓博;黃有德;;氟對(duì)動(dòng)物破骨細(xì)胞的影響[A];2003全國(guó)家畜內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文專輯[C];2003年

4 楊肖;張美;吳家順;湯亞玲;陳宇;;雙熒光標(biāo)記小鼠模型研究破骨細(xì)胞融合過(guò)程初探[A];2018口腔病理年會(huì)暨第十二次全國(guó)口腔病理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2018年

5 趙志虎;馬信龍;孫曉雷;馬劍雄;李風(fēng)波;李艷軍;呂建偉;孟新民;;循環(huán)牽張應(yīng)力對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收活性和凋亡的影響[A];第十一屆全國(guó)生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第十三屆全國(guó)生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議論文摘要匯編[C];2015年

6 杜文喜;童培建;;體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素和分子機(jī)制研究進(jìn)展[A];全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)骨傷科專業(yè)委員會(huì)第十二次學(xué)術(shù)年會(huì)浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)骨傷科專業(yè)委員會(huì)第十次學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2004年

7 周平;高豐;;17β-雌二醇對(duì)破骨細(xì)胞的影響[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十二次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2012年

8 韓大慶;張其清;;破骨細(xì)胞完善類骨組織體外重建的研究[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2006年

9 李建宇;劉璐;萬(wàn)宗明;郝慶新;郭勇;李瑞欣;張西正;;基底拉伸應(yīng)變對(duì)共育體系中成骨與破骨細(xì)胞的影響[A];第十屆全國(guó)生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第十二屆全國(guó)生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2012年

10 李宏宇;;股骨頭壞死不同區(qū)域微血管密度、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表達(dá)的研究[A];第二十四屆中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合骨傷科學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2017年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 錢(qián)錚;日本發(fā)現(xiàn)抑制破骨細(xì)胞作用的物質(zhì)[N];中國(guó)勞動(dòng)保障報(bào);2006年

2 錢(qián)錚;“W9肽”可抑制破骨細(xì)胞生成[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

3 小新;日發(fā)現(xiàn)雌激素可抑制破骨細(xì)胞作用[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年

4 ;雌激素可抑制破骨細(xì)胞作用[N];農(nóng)村醫(yī)藥報(bào)（漢）;2007年

5 范思立;補(bǔ)鈣亟需開(kāi)創(chuàng)新領(lǐng)域[N];中國(guó)經(jīng)濟(jì)時(shí)報(bào);2007年

6 暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心 姚成燦;TGF-β：重塑傲骨舍我其誰(shuí)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2001年

7 記者 顏秋雨 通訊員 王玉林 王建新;中美專家揭示骨生成“三元調(diào)控”機(jī)制[N];健康報(bào);2014年

8 編譯 紫箕;2010年獲批的小分子藥物[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2011年

9 鮑捷;抑制破骨細(xì)胞 讓骨質(zhì)疏松剎車(chē)[N];健康報(bào);2003年

10 記者 王小龍;科學(xué)家發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞抑制劑[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 高延盼;組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

2 李殿奇;PDGF-BB調(diào)節(jié)成、破骨細(xì)胞的作用機(jī)制及促進(jìn)骨愈合的實(shí)驗(yàn)研究[D];武漢大學(xué);2016年

3 竇策;非編碼RNA參與調(diào)控破骨細(xì)胞前體融合及其多種干預(yù)策略的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

4 馮燕陵;FoxO1介導(dǎo)白藜蘆醇、葛根素抑制破骨細(xì)胞生成和活性的機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2018年

5 王莉芳;時(shí)滯與噪聲在生物信號(hào)通路中的效應(yīng)研究[D];華中師范大學(xué);2018年

6 王東;破骨細(xì)胞前體中VDR的激活對(duì)小鼠破骨細(xì)胞分化和活性的影響[D];揚(yáng)州大學(xué);2018年

7 遲志永;重組人類骨保護(hù)蛋白畢赤酵母分泌性表達(dá)株的構(gòu)建及系列研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2004年

8 黃鵬;聯(lián)合應(yīng)用重組人骨保護(hù)素和二膦酸鹽抑制破骨細(xì)胞及治療骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2005年

9 孫惠強(qiáng);流體剪切力對(duì)破骨細(xì)胞及其TRAP酶活性與RANKL mRNA表達(dá)水平的影響[D];四川大學(xué);2004年

10 黃魯豫;辛伐他汀、甲狀旁腺素相關(guān)肽（PTHrP）在破骨細(xì)胞生成和骨吸收中的作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張輝;鐵調(diào)素過(guò)表達(dá)對(duì)鐵蓄積小鼠破骨細(xì)胞和骨量影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2018年

2 劉少偉;兔抗破骨細(xì)胞蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶多克隆抗體的制備與應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2018年

3 賴敏鋒;破骨細(xì)胞外泌小體促進(jìn)成骨前體細(xì)胞成骨分化的初步研究[D];暨南大學(xué);2016年

4 王柄棋;基于Src-PI3K-Akt通路探討健骨顆粒乙酸乙酯萃取部位對(duì)破骨細(xì)胞功能的影響[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2018年

5 馬文強(qiáng);CTLA-4-Ig影響破骨細(xì)胞分化成熟的初步研究[D];川北醫(yī)學(xué)院;2018年

6 逄丹丹;白介素-23誘導(dǎo)破骨細(xì)胞表達(dá)成骨分子[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

7 孫自強(qiáng);AKT/mTOR/ULK1介導(dǎo)的自噬在骨保護(hù)素調(diào)控破骨細(xì)胞骨吸收活性中的作用機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2017年

8 劉欣;促黑素對(duì)破骨細(xì)胞形成及信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響[D];濱州醫(yī)學(xué)院;2012年

9 葉秋瑩;基于破骨細(xì)胞功能探討腺苷激酶敲除小鼠和貞術(shù)調(diào)脂膠囊對(duì)骨代謝的影響[D];廣東藥科大學(xué);2017年

10 梁思敏;TNF-α基因shRNA影響脊柱結(jié)核破骨細(xì)胞形成的實(shí)驗(yàn)研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2822404