研究背景：肥胖是脂肪的合成與組織中脂肪的氧化不平衡所致,進而在人體唯一的能量儲存庫中將多余的能量和脂肪儲存起來(在脂肪細胞中以甘油三酯的形式儲存),但又缺乏有效的負反饋機制來清除堆積的脂肪。肥胖已成為當今世界重要的健康危害,而且發(fā)病率正逐年上升。1982年到2002年的20年間,中國的肥胖及超重的患病率增加了4.1倍,從3.7%增加到了19.0%,并且仍有快速增加的趨勢。肥胖患病率增加的主要原因包括飲食結(jié)構(gòu)的改變,生活水平的提高,體力活動的減少及城市化程度的增加。中心型肥胖越來越普遍,兩個基于上海人群的橫斷面研究顯示,近20年來,中心型肥胖的患病率已經(jīng)從19.5%增加到27.3%。肥胖是多種代謝性疾病的危險因素,主要包括2型糖尿病,高血壓、冠心病和非酒精性脂肪肝。肥胖相關(guān)的代謝性疾病常伴有血脂指標的異常,這些指標的異常常由于較高的血甘油三酯水平及甘油三酯的異位沉積導致。白色脂肪組織主要由白色脂肪細胞構(gòu)成,它的主要功能是調(diào)節(jié)能量代謝及以甘油三酯的形式儲存能量。它還參與其他生物學過程,如血管生成,控制血壓及免疫。白色脂肪組織主要是通過分泌激素及細胞因子調(diào)節(jié)上述生物學過程。肥胖的發(fā)病原因十分復(fù)雜,遺傳和環(huán)境因素均可以影響它的發(fā)生、發(fā)展和易感性。本課題主要研究激素參與肥胖的發(fā)生、發(fā)展。亞臨床甲狀腺功能減退(Subclinical hypothyroidism),簡稱亞甲減,指血清促甲狀腺激素(TSH)水平超過正常值上限而血清游離甲狀腺素正常的一組臨床綜合征。亞臨床甲減是臨床常見的甲狀腺功能異常,成年人中患病率約為4-20%。近年來隨著臨床檢驗水平的進步,亞臨床甲減的檢出率明顯上升,人們對亞臨床甲減的研究也進一步深入。既往研究顯示亞臨床甲減能引起心臟功能障礙,精神和認知功能障礙,神經(jīng)肌肉功能異常。近年來研究表明亞臨床甲減與血脂異常、肥胖的發(fā)生有關(guān),但患者甲狀腺自身抗體、血壓以及體重指數(shù)這些參數(shù)均不能合理解釋這種相關(guān)性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)脂肪細胞的細胞膜表面有功能性的促甲狀腺激素受體(TSHR)的表達,因此有學者提出TSH可能通過作用于脂肪細胞表面的TSH受體,改變脂肪細胞的生長、分化及調(diào)節(jié)脂肪細胞的多種分泌功能,從而影響肥胖的發(fā)生。TSH的主要作用是刺激甲狀腺增殖、碘攝取、甲狀腺激素的合成和釋放。流行病學研究顯示亞臨床甲減患者血清TSH水平與肥胖程度呈正相關(guān)；即使在甲功正常者TSH水平也與BMI呈正相關(guān)；肥胖患者血清TSH水平亦較非肥胖患者高。以上研究均說明TSH與肥胖之間有內(nèi)在的關(guān)聯(lián),但TSH影響肥胖的具體分子機制不明。既往研究認為TSH受體僅表達與甲狀腺組織。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)TSH受體表達在甲狀腺外的組織,如脂肪,肝臟等。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)TSH能促進3T3-L1前脂肪細胞向脂肪細胞分化,干擾掉TSH受體后3T3-L1前脂肪細胞的分化受到抑制。Haraguchi等研究也發(fā)現(xiàn)大鼠前脂肪細胞誘導、分化過程中伴隨著TSH受體的表達。Valyasevi等在人體眶內(nèi)前脂肪細胞向脂肪細胞的分化過程中也伴有TSH受體的表達。Lu等在對小鼠胚胎干細胞的研究中發(fā)現(xiàn)TSH能刺激脂肪生成。以上研究均顯示TSH參與脂肪細胞的分化。肥胖的特征是一種肥大性疾病,包括增加的脂肪細胞數(shù)量和增大的脂肪細胞體積兩個方面。本實驗室之前研究已經(jīng)證實TSH可以通過促進前脂肪細胞向脂肪細胞的分化來增加脂肪細胞的數(shù)量。脂肪細胞的數(shù)量多少主要是在兒童及青春期決定。脂肪細胞的肥大(即脂肪細胞體積增加)的主因是甘油三酯合成增加,并且是成年人肥胖的主要原因。Beook等研究顯示所有肥胖的人均有脂肪細胞的體積增大,但是脂肪細胞的數(shù)量增加僅見于肥胖的兒童及兒童時期即肥胖的成人。因此,脂肪細胞體積(即細胞內(nèi)甘油三酯含量)是成年人肥胖與否的決定因素。然而,TSH調(diào)節(jié)成熟脂肪細胞甘油三酯合成的作用還有待進一步研究。甘油磷酸�；D(zhuǎn)移酶(GPAT)是人體內(nèi)甘油三酯合成的限速酶。GPAT3是脂肪細胞中GPAT最重要的亞型,在脂肪細胞甘油三酯合成中起最重要的作用。在哺乳動物細胞中過表達GPAT3能促進甘油三酯合成,而在3T3-L1脂肪細胞中敲除GPAT3能抑制甘油三酯合成。目前研究顯示GPAT3的表達及活性主要受胰島素,乙醇,糖皮質(zhì)激素受體及噻唑烷二酮類藥物的調(diào)節(jié)。然而,TSH是否通過調(diào)節(jié)成熟脂肪細胞的GPAT3表達影響甘油三酯合成尚有待研究。目前,TSH對肥胖作用的具體集中研究的研究仍較少見,TSH如何調(diào)節(jié)成熟脂肪細胞甘油三酯合成并進一步引起肥胖的分子機制仍有待進一步研究。本項目將進一步探討在TSH對脂肪細胞甘油三酯合成的作用,并在小鼠體內(nèi)研究其在肥胖發(fā)生中所起的作用。并采用細胞及分子生物學的方法,建立成熟脂肪細胞的模型,研究其信號通路及分子機制,從而進一步揭示TSH與GPAT3表達之間的關(guān)系。目前,通過調(diào)整激素水平抑制食欲、增加能量消耗以控制體重的增加已經(jīng)成為目前肥胖治療研究熱點之一。本研究從新的角度探討了激素對肥胖形成機制的認識,并可能為亞臨床甲狀腺功能減退合并肥胖的治療開拓思路及提供理論依據(jù)。目的：1、確定促甲狀腺激素調(diào)節(jié)脂肪組織甘油三酯含量,利用亞臨床甲狀腺功能減退的小鼠模型及TSH刺激的成熟3T3-L1脂肪細胞研究TSH對脂肪細胞甘油三酯合成的作用。2、通過TSH受體敲除的小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的mRNA變化,篩選出TSH可能的作用靶點。3、通過TSH刺激成熟3T3-L1脂肪細胞,檢鋇GPAT3、PPAR γ、p-AMPK、t-AMPK的蛋白、mRNA水平,探討TSH引起脂質(zhì)合成增加的可能機制。4、通過TSH受體敲除的小鼠模型,檢測GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的蛋白、mRNA水平,進一步探討TSH引起脂質(zhì)合成增加的可能機制。5、利用PPAR γ、AMPK特異性阻斷劑或TSHR、PPARγ、GPAT3特異性小干擾RNA (Small Interfering RNA, siRNA)或轉(zhuǎn)染持續(xù)激活或抑制性AMPK質(zhì)粒處理細胞,檢鋇GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的表達,探討TSHR、AMPK、 PPARγ、GPAT3在TSH所引起的脂質(zhì)沉積中所起的作用。研究方法：1、細胞培養(yǎng)：1)3T3-L1細胞根據(jù)美國模式菌種收集中心(ATCC)細胞培養(yǎng)標準使用高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)、誘導分化。2)人脂肪原代細胞、小鼠脂肪原代細胞人或小鼠脂肪組織剪碎,使用Ⅰ型膠原酶在37℃孵箱中消化30-40 min,過篩去掉未消化的組織,PBS沖洗細胞,并接種在新的培養(yǎng)皿中,使用含新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。2、動物模型：通過小劑量他巴唑喂養(yǎng)建立亞臨床甲狀腺功能減退小鼠模型,并在Jackson實驗室購買TSHR敲除小鼠模型。3、采用RT-PCR檢測GPAT3、PPARγ mRNA的表達。4、采用Western Blotting檢測GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK及beta-actin蛋白水平變化。5、采用免疫熒光方法檢測GPAT3、PPARγ在脂肪組織及細胞中的表達,HE染色了解組織結(jié)構(gòu)。6.GPAT3、PPARγ及TSHR基因沉默：以GPAT3、PPARγ及TSHR特異性siRNA轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細胞以沉默GPAT3、PPARγ及TSHR表達。7、AMPK持續(xù)激活或抑制：以CA-AMPK或DN-AMPK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細胞以持續(xù)激活或抑制AMPK表達。8、GPAT3、PPARγ活性檢測：采用熒光素酶報告基因的方法檢測GPAT3、 PPARγ的活性。9、采用酶聯(lián)免疫分析檢測小鼠體內(nèi)adiponectin的水平變化。結(jié)果：1、促甲狀腺激素調(diào)節(jié)脂肪組織甘油三酯含量：亞臨床甲狀腺功能減退的小鼠表現(xiàn)為體重增加,總脂肪重量增加,有較高的BMI水平及附睪脂肪指數(shù)。進一步處死小鼠后分別觀察了兩組小鼠的附睪、腎周白色脂肪組織的外觀及脂肪細胞的體積大小(HE染色),發(fā)現(xiàn)亞臨床甲狀腺功能減退的小鼠附睪、腎周白色脂肪組織含量較對照組小鼠顯著增加,脂肪細胞體積增大。通過體外實驗證實,促甲狀腺激素刺激顯著增加成熟的3T3-L1脂肪細胞內(nèi)的脂滴數(shù)量。與之一致的,3T3-L1脂肪細胞內(nèi)的甘油三酯含量在TSH的刺激下呈時間、劑量依賴性的增加。2、TSH調(diào)節(jié)甘油三酯合成是通過GPAT3:體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),TSHR敲除的小鼠體內(nèi)GPAT3 mRNA及蛋白表達均顯著下降。體外研究發(fā)現(xiàn)TSH能刺激GPAT3的蛋白表達及其在胞漿的聚集并增加GPAT3的活性。利用GPAT3 siRNA干擾掉GPAT3后,TSH介導的甘油三酯合成被阻斷。3.PPARγ在促甲狀腺激素介導的脂質(zhì)生成中是必不可少的：體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),TSHR敲除的小鼠PPARγ mRNA水平較對照組小鼠水平下降。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)TSHR敲除的小鼠PPARγ蛋白較對照組小鼠表達水平下降。體外研究顯示,在成熟的3T3-L1脂肪細胞中,利用免疫熒光的方法檢鋇PPARγ的蛋白表達,發(fā)現(xiàn)TSH刺激的細胞PPARγ蛋白在細胞核內(nèi)的聚集明顯。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),TSH刺激的成熟的3T3-L1脂肪細胞、人原代脂肪細胞及小鼠原代脂肪細胞中PPAγ核蛋白表達顯著增加。實時定量PCR顯示促甲狀腺激素刺激的成熟的3T3-L1脂肪細胞PPARγ mRNA表達顯著增加。利用PPARγ siRNA干擾掉PPARγ后,TSH介導的甘油三酯合成及激活GPAT3的作用被阻斷。4、AMPK介導TSH引起的PPARγ/GPAT3上調(diào)及脂質(zhì)合成：體內(nèi)實驗證實,AICAR喂養(yǎng)的TSHR受體敲除的小鼠脂肪組織PPARγ、GPAT3的蛋白、mRNA表達均下降。體外研究顯示,轉(zhuǎn)染CA-AMPK抑制TSH引起的PPARγ/GPAT3上調(diào)及脂質(zhì)合成；轉(zhuǎn)染DN-AMPK激活TSH引起的PPARγ/GPAT3上調(diào)及脂質(zhì)合成。5、TSHR參與TSH介導的脂質(zhì)生成：體內(nèi)實驗證實,TSHR敲除的小鼠表現(xiàn)為體重下降,附睪脂肪重量降低,有較低的附睪脂肪指數(shù)。進一步處死小鼠后分別觀察了兩組小鼠的附睪、腎周白色脂肪組織的外觀及脂肪細胞的體積大小(HE染色),發(fā)現(xiàn)TSHR敲除的小鼠附睪、腎周白色脂肪組織含量較野生型小鼠顯著降低,脂肪細胞體積下降。Western顯示TSHR敲除的小鼠GPAT3表達下降。通過體外實驗證實,利用TSHR siRNA干擾掉TSHR后,TSH介導的甘油三酯合成及激活A(yù)MPK/PPARγ/GPAT3的作用被阻斷。結(jié)論：在成熟脂肪細胞中,TSH通過結(jié)合到TSH受體,阻斷AMPK Thr172位點的磷酸化,激活PPARγ轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng),進而增加GPAT3的表達,促進肥胖的發(fā)生和發(fā)展。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R589.2

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本文編號：2818609