研究背景伴隨人口老齡化,骨質(zhì)疏松發(fā)病率有逐年增高趨勢(shì)。老齡化引起骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力下降與骨質(zhì)疏松發(fā)病存在密切關(guān)系。目前普遍認(rèn)為,骨質(zhì)疏松的病理生理學(xué)基礎(chǔ)在于成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收功能失衡。因此,對(duì)于骨質(zhì)疏松的治療主要以藥物為主,臨床上常用的骨吸收抑制劑主要包括雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素以及雌激素。盡管各類抗骨質(zhì)疏松藥物在臨床治療中取得了一定的療效,但目前對(duì)于骨質(zhì)疏松的治療仍然未有明確的靶點(diǎn),無明確的機(jī)制以及精準(zhǔn)的治療。老年性雌激素缺乏的骨質(zhì)疏松患者可以通過口服DHEA來治療,臨床已經(jīng)表明DHEA能夠改善骨質(zhì)疏松癥狀,促進(jìn)骨密度增加。DHEA主要由腎上腺分泌,同時(shí)也由性腺和大腦分泌,可在在外周組織通過轉(zhuǎn)化雄激素或雌激素發(fā)揮作用,然而目前為止,對(duì)DHEA促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的蛋白質(zhì)分子的基礎(chǔ)研究,未見報(bào)道。而各類含DHEA抗骨質(zhì)疏松的藥物在臨床治療仍然未有明確的靶點(diǎn),未曾有明確的機(jī)制以及精準(zhǔn)的治療。本項(xiàng)目擬采用hMSCs成骨誘導(dǎo)體系±DHEA,采集不同時(shí)間點(diǎn)的藥物處理組與對(duì)照組蛋白,首先證實(shí)DHEA對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力測(cè)定以及對(duì)相關(guān)基因表達(dá)情況的分析,再運(yùn)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)創(chuàng)建藥物處理組和對(duì)照組的差異蛋白表達(dá)譜,通過對(duì)差異性蛋白質(zhì)分子進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞成分及可能涉及的信號(hào)通路分析,選擇潛在分子標(biāo)志物為目標(biāo),運(yùn)用RT-PCR及Western-Blotting對(duì)篩選出的重要差異分子進(jìn)行驗(yàn)證,分析該分子在DHEA促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的作用,為進(jìn)一步探索該蛋白在提高干細(xì)胞成骨分化能力潛在的應(yīng)用價(jià)值提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究目的DHEA與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力存在密切關(guān)系,通過研究DHEA促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程,對(duì)比DHEA、成骨誘導(dǎo)體系以及DHEA存在成骨誘導(dǎo)體系中對(duì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響,并深入研究此過程中蛋白質(zhì)種類、數(shù)量有何改變,是否存在特征性差異蛋白在整個(gè)MSCs向成骨細(xì)胞分化的過程中表達(dá)逐漸增高或降低,可作為促進(jìn)MSCs成骨分化的藥物治療靶標(biāo),且特征性差異蛋白分子的作用機(jī)制以及與MSCs成骨分化的關(guān)系,為DHEA臨床治療骨質(zhì)疏松提供臨床依據(jù)。研究方法(1)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及藥物處理:提取健康成年人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并培養(yǎng)至第三代,以DHEA±成骨誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)BMSCs定向成骨細(xì)胞分化,于4、7、14天測(cè)定成骨細(xì)胞ALP活性及相關(guān)成骨基因(Alp\Oop\Bmp2\Runx2\Col1a1\Smad1)的表達(dá)檢測(cè),并行堿性磷酸酶、茜素紅染色,觀察成骨分化程度。(2)質(zhì)譜分析測(cè)定相關(guān)差異蛋白的種類及數(shù)量:提取各組總蛋白,測(cè)定蛋白濃度,還原烷基化處理,然后蛋白酶解,采用TMT試劑對(duì)全部肽段進(jìn)行標(biāo)記,然后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,篩選DHEA促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的差異蛋白。差異蛋白的表達(dá)驗(yàn)證:應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)各組DHEA促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化中差異蛋白CHAD在mRNA水平的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用Western-Blotting技術(shù)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)各組DHEA促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中差異蛋白在蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。研究結(jié)果(1)考察各組對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力:各分組中,DHEA+成骨誘導(dǎo)體系對(duì)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用最明顯,表現(xiàn)在成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測(cè)上效果最優(yōu),成骨誘導(dǎo)組次之,單純藥物組性能最低。茜素紅染色及堿性磷酸酶染色均表現(xiàn)為各分組中DHEA+成骨誘導(dǎo)體系組誘導(dǎo)效果最優(yōu);RT-PCR檢測(cè)相關(guān)成骨基因中,較空白對(duì)照組,其他各組均有成骨基因上調(diào),其中DHEA+誘導(dǎo)組上調(diào)更明顯,相比之下,單純誘導(dǎo)液組及單純藥物組效果次之。(2)質(zhì)譜分析:在2次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)中,第一次質(zhì)譜鑒定到了290495個(gè)二級(jí)譜圖數(shù)目,使用賽默飛蛋白質(zhì)組學(xué)比對(duì)軟件,可從從數(shù)據(jù)庫中匹配到相應(yīng)的123950個(gè)肽段譜圖,對(duì)應(yīng)到了59073個(gè)肽段的總數(shù),經(jīng)過總數(shù)的肽段再次與數(shù)據(jù)庫比對(duì),得出鑒定到的唯一肽段共有45808個(gè),最總鑒定到的蛋白是根據(jù)唯一肽段在數(shù)據(jù)庫中比對(duì)而得來,共得到蛋白綜述6649個(gè)。第二次質(zhì)譜鑒定結(jié)果,鑒定到了294253個(gè)數(shù)目的譜圖數(shù),經(jīng)賽默飛蛋白組學(xué)發(fā)掘軟件2.1版本從數(shù)據(jù)庫中比對(duì)到的肽段譜圖數(shù)為127343個(gè),與之相對(duì)應(yīng)了59125個(gè)肽段,將所有的肽段精確比對(duì),可以得出45975個(gè)唯一肽段,最終可以從數(shù)據(jù)庫中匹配到6699個(gè)蛋白質(zhì)。我們將蛋白組學(xué)中差異蛋白的最低表達(dá)差異倍數(shù)超過1.2倍,并且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)最小顯著差異法篩選出與空白組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(統(tǒng)計(jì)后P值小于0.05)的篩選標(biāo)準(zhǔn)確定為有意義的差異蛋白質(zhì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下:在脫氫表雄酮干預(yù)的干細(xì)胞成骨分化組中,與空白組相比,符合條件的差異蛋白在4天組中總數(shù)為566個(gè),其中有341個(gè)為上調(diào)的蛋白,有225個(gè)為下調(diào)的蛋白;7天組中相應(yīng)的總蛋白為587個(gè),其中上調(diào)了321個(gè),表達(dá)下降的差異蛋白數(shù)目為266個(gè);14天組有變化的總蛋白數(shù)目為459個(gè),其中上調(diào)1.2倍以上的蛋白數(shù)目為281個(gè),下降倍數(shù)達(dá)到1.2倍的差異蛋白數(shù)目為178個(gè)。其中誘導(dǎo)體系處理組中,4天組表達(dá)差異的蛋白總數(shù)為606個(gè),其中上調(diào)及下調(diào)1.2倍以上的蛋白分別為362個(gè)以及244個(gè);7天處理組724個(gè)差異蛋白中包含了405個(gè)上調(diào)的蛋白以及319個(gè)下調(diào)的蛋白;14天組的總蛋白為524個(gè),其中顯著上調(diào)的數(shù)目為302個(gè),顯著下調(diào)的數(shù)目為222個(gè)。脫氫表雄酮在成骨誘導(dǎo)體系中對(duì)干細(xì)胞成骨分化組誘導(dǎo)組中,4天組改變的總蛋白數(shù)目為712個(gè),其中上調(diào)1.2倍以上為407個(gè),下調(diào)的數(shù)目為305;7天組中共有666個(gè),其中顯著上調(diào)為369個(gè),下調(diào)297個(gè)蛋白;14天組中變化的蛋白數(shù)目為547個(gè),顯著上調(diào)了317個(gè),顯著下調(diào)了230個(gè)。將質(zhì)樸分析得出的蛋白中,我們根據(jù)蛋白功能分類進(jìn)行了分析,主要是通過GO注釋,以及GO功能注釋后差異蛋白參與的功能的富集分析,以及差異蛋白所富集在的信號(hào)通路做圖分析,根據(jù)主要富集的信號(hào)通路功能來確定感興趣的蛋白以及信號(hào)通路進(jìn)行下一步分析。相應(yīng)的注釋分析以及富集分析均經(jīng)過費(fèi)舍爾檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)。我們將個(gè)分組中持續(xù)上調(diào)的差異蛋白進(jìn)行篩選,通過比對(duì)數(shù)據(jù)庫,功能注釋以及富集的通路及功能分析,篩選出有潛力的蛋白富含亮氨酸軟骨蛋白(Chondroadherin CHAD)作為下一步研究的特征性蛋白。并對(duì)各組中特征性蛋白CHAD行RT-PCR驗(yàn)證,CHAD在DHEA+誘導(dǎo)組中在同一時(shí)間分組中表達(dá)量最高,且在第14天表達(dá)量最高,與質(zhì)譜中蛋白含量升高倍數(shù)一致。研究結(jié)論DHEA成骨誘導(dǎo)體系比其他組更明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,并上調(diào)成骨相關(guān)基因;篩選出可能調(diào)控DHEA誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的相關(guān)蛋白分子富含亮氨酸軟骨蛋白(Chondroadherin CHAD),并在基因水平驗(yàn)證了其存在。根據(jù)KEGG及GO分析,其機(jī)制可能是CHAD/JAK/STAT信號(hào)通路的激活,并激活下游關(guān)鍵基因干擾素調(diào)節(jié)因子9(IRF9)的表達(dá),最終使DHEA表達(dá)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的效果,從而參與到誘導(dǎo)成骨形成的過程。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

圖 1-1 藥物濃度篩選實(shí)驗(yàn)（MTT 法）：體外檢測(cè)干細(xì)胞使用含不同濃度的 DHEA 培養(yǎng)基培養(yǎng)示同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度檢測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物最適濃度的篩選結(jié)果。Fig 1-1 Drug concentration screening test (MTT method): In vitro detection of stem cells usingdifferent concentrations of DHEA medium culture, showing the same time point of differentconcentrations of cells to detect the optimal concentration of drug screening results3.2 茜素紅染色觀察茜素紅 S 是橙黃色的針狀體。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和1%水溶液 pH2.15。由茜素經(jīng)發(fā)煙硫酸磺化，然后轉(zhuǎn)變?yōu)殁c鹽制得一種蒽醌(Anthraquinone)類的衍生物，是茜素磺酸鈉鹽。茜素紅可成骨細(xì)胞中的鈣鹽鰲和成紅色物，因干細(xì)胞沒有成骨細(xì)胞所特有的成分，因此用茜素紅染色可以評(píng)價(jià)干細(xì)胞是否成骨分化。通過判斷

圖 1-2 DHEA 組、誘導(dǎo)組及 DHEA+誘導(dǎo)組 4 天、7 天、14 天的茜素紅染色(200×)Fig 1-2 Adenosine red staining of DHEA group, induction group and DHEA+ induction group at da4, 7 and 14 (200×)3.3 堿性磷酸酶染色觀察及細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性檢測(cè)堿性磷酸酯酶是一類成骨細(xì)胞分泌，可視為干細(xì)胞成功向成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，利用蛋白酶裂解液將細(xì)胞裂解后，細(xì)胞內(nèi)的酶釋放出來后可高效的針對(duì)單酯磷酸并將磷酸基水解，水解磷酸基團(tuán)后生成磷酸根離子，并在堿性條件下最為有效。該酶是一組同功酶的統(tǒng)稱。經(jīng)過堿性磷酸酯酶的催化可將 BCIP 水解出來的反應(yīng)物繼續(xù)于 NBT 反應(yīng)，生成的四唑硝基藍(lán)是一種不溶性的，呈藍(lán)紫色的結(jié)晶。根據(jù)結(jié)晶顏色可判斷爬片

RAQ 技術(shù)的脫氫表雄酮(DHEA)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化機(jī)制研究 2015 級(jí)碩士學(xué)位論文、誘導(dǎo)組及 DHEA+誘導(dǎo)組在第 4 天的時(shí)候并未出現(xiàn)明顯的藍(lán)色或者藍(lán)色的沉淀，而第 7 天時(shí)候除空白組均有 ALP 染色出現(xiàn)，其中 DHEA+誘組染色程度在同一時(shí)間點(diǎn)明顯高于其他兩組，且在第 14 天中更為明。細(xì)胞內(nèi) ALP 活性水平如圖所示，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，ALP 的活性均加，其中 DHEA+誘導(dǎo)組活性最高，誘導(dǎo)組次之，其中在第 14 天時(shí)候組均呈現(xiàn)出較高的表達(dá)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 周予婧;王樸;陳紅英;劉遄;季僑丹;陽筱甜;高強(qiáng);何成奇;;脈沖電磁場(chǎng)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、成骨分化和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2015年03期

2 鄭潔;瞿茹怡;李圣賢;徐玉梅;陸詠;;體質(zhì)指數(shù)對(duì)老年男性骨質(zhì)疏松的影響[J];藥學(xué)服務(wù)與研究;2014年03期

本文編號(hào)：2815347