研究背景伴隨人口老齡化,骨質(zhì)疏松發(fā)病率有逐年增高趨勢。老齡化引起骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力下降與骨質(zhì)疏松發(fā)病存在密切關(guān)系。目前普遍認(rèn)為,骨質(zhì)疏松的病理生理學(xué)基礎(chǔ)在于成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收功能失衡。因此,對于骨質(zhì)疏松的治療主要以藥物為主,臨床上常用的骨吸收抑制劑主要包括雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素以及雌激素。盡管各類抗骨質(zhì)疏松藥物在臨床治療中取得了一定的療效,但目前對于骨質(zhì)疏松的治療仍然未有明確的靶點,無明確的機制以及精準(zhǔn)的治療。老年性雌激素缺乏的骨質(zhì)疏松患者可以通過口服DHEA來治療,臨床已經(jīng)表明DHEA能夠改善骨質(zhì)疏松癥狀,促進骨密度增加。DHEA主要由腎上腺分泌,同時也由性腺和大腦分泌,可在在外周組織通過轉(zhuǎn)化雄激素或雌激素發(fā)揮作用,然而目前為止,對DHEA促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的蛋白質(zhì)分子的基礎(chǔ)研究,未見報道。而各類含DHEA抗骨質(zhì)疏松的藥物在臨床治療仍然未有明確的靶點,未曾有明確的機制以及精準(zhǔn)的治療。本項目擬采用hMSCs成骨誘導(dǎo)體系±DHEA,采集不同時間點的藥物處理組與對照組蛋白,首先證實DHEA對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力測定以及對相關(guān)基因表達情況的分析,再運用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)創(chuàng)建藥物處理組和對照組的差異蛋白表達譜,通過對差異性蛋白質(zhì)分子進行相關(guān)細(xì)胞成分及可能涉及的信號通路分析,選擇潛在分子標(biāo)志物為目標(biāo),運用RT-PCR及Western-Blotting對篩選出的重要差異分子進行驗證,分析該分子在DHEA促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的作用,為進一步探索該蛋白在提高干細(xì)胞成骨分化能力潛在的應(yīng)用價值提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。研究目的DHEA與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力存在密切關(guān)系,通過研究DHEA促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程,對比DHEA、成骨誘導(dǎo)體系以及DHEA存在成骨誘導(dǎo)體系中對干細(xì)胞成骨分化能力的影響,并深入研究此過程中蛋白質(zhì)種類、數(shù)量有何改變,是否存在特征性差異蛋白在整個MSCs向成骨細(xì)胞分化的過程中表達逐漸增高或降低,可作為促進MSCs成骨分化的藥物治療靶標(biāo),且特征性差異蛋白分子的作用機制以及與MSCs成骨分化的關(guān)系,為DHEA臨床治療骨質(zhì)疏松提供臨床依據(jù)。研究方法(1)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及藥物處理:提取健康成年人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并培養(yǎng)至第三代,以DHEA±成骨誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)BMSCs定向成骨細(xì)胞分化,于4、7、14天測定成骨細(xì)胞ALP活性及相關(guān)成骨基因(Alp\Oop\Bmp2\Runx2\Col1a1\Smad1)的表達檢測,并行堿性磷酸酶、茜素紅染色,觀察成骨分化程度。(2)質(zhì)譜分析測定相關(guān)差異蛋白的種類及數(shù)量:提取各組總蛋白,測定蛋白濃度,還原烷基化處理,然后蛋白酶解,采用TMT試劑對全部肽段進行標(biāo)記,然后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析,篩選DHEA促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的差異蛋白。差異蛋白的表達驗證:應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對不同時間點各組DHEA促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化中差異蛋白CHAD在mRNA水平的表達進行驗證。應(yīng)用Western-Blotting技術(shù)對不同時間點各組DHEA促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中差異蛋白在蛋白水平的表達進行驗證。研究結(jié)果(1)考察各組對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力:各分組中,DHEA+成骨誘導(dǎo)體系對促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用最明顯,表現(xiàn)在成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測上效果最優(yōu),成骨誘導(dǎo)組次之,單純藥物組性能最低。茜素紅染色及堿性磷酸酶染色均表現(xiàn)為各分組中DHEA+成骨誘導(dǎo)體系組誘導(dǎo)效果最優(yōu);RT-PCR檢測相關(guān)成骨基因中,較空白對照組,其他各組均有成骨基因上調(diào),其中DHEA+誘導(dǎo)組上調(diào)更明顯,相比之下,單純誘導(dǎo)液組及單純藥物組效果次之。(2)質(zhì)譜分析:在2次重復(fù)的實驗中,第一次質(zhì)譜鑒定到了290495個二級譜圖數(shù)目,使用賽默飛蛋白質(zhì)組學(xué)比對軟件,可從從數(shù)據(jù)庫中匹配到相應(yīng)的123950個肽段譜圖,對應(yīng)到了59073個肽段的總數(shù),經(jīng)過總數(shù)的肽段再次與數(shù)據(jù)庫比對,得出鑒定到的唯一肽段共有45808個,最總鑒定到的蛋白是根據(jù)唯一肽段在數(shù)據(jù)庫中比對而得來,共得到蛋白綜述6649個。第二次質(zhì)譜鑒定結(jié)果,鑒定到了294253個數(shù)目的譜圖數(shù),經(jīng)賽默飛蛋白組學(xué)發(fā)掘軟件2.1版本從數(shù)據(jù)庫中比對到的肽段譜圖數(shù)為127343個,與之相對應(yīng)了59125個肽段,將所有的肽段精確比對,可以得出45975個唯一肽段,最終可以從數(shù)據(jù)庫中匹配到6699個蛋白質(zhì)。我們將蛋白組學(xué)中差異蛋白的最低表達差異倍數(shù)超過1.2倍,并且經(jīng)統(tǒng)計學(xué)最小顯著差異法篩選出與空白組有統(tǒng)計學(xué)意義(統(tǒng)計后P值小于0.05)的篩選標(biāo)準(zhǔn)確定為有意義的差異蛋白質(zhì)。統(tǒng)計結(jié)果如下:在脫氫表雄酮干預(yù)的干細(xì)胞成骨分化組中,與空白組相比,符合條件的差異蛋白在4天組中總數(shù)為566個,其中有341個為上調(diào)的蛋白,有225個為下調(diào)的蛋白;7天組中相應(yīng)的總蛋白為587個,其中上調(diào)了321個,表達下降的差異蛋白數(shù)目為266個;14天組有變化的總蛋白數(shù)目為459個,其中上調(diào)1.2倍以上的蛋白數(shù)目為281個,下降倍數(shù)達到1.2倍的差異蛋白數(shù)目為178個。其中誘導(dǎo)體系處理組中,4天組表達差異的蛋白總數(shù)為606個,其中上調(diào)及下調(diào)1.2倍以上的蛋白分別為362個以及244個;7天處理組724個差異蛋白中包含了405個上調(diào)的蛋白以及319個下調(diào)的蛋白;14天組的總蛋白為524個,其中顯著上調(diào)的數(shù)目為302個,顯著下調(diào)的數(shù)目為222個。脫氫表雄酮在成骨誘導(dǎo)體系中對干細(xì)胞成骨分化組誘導(dǎo)組中,4天組改變的總蛋白數(shù)目為712個,其中上調(diào)1.2倍以上為407個,下調(diào)的數(shù)目為305;7天組中共有666個,其中顯著上調(diào)為369個,下調(diào)297個蛋白;14天組中變化的蛋白數(shù)目為547個,顯著上調(diào)了317個,顯著下調(diào)了230個。將質(zhì)樸分析得出的蛋白中,我們根據(jù)蛋白功能分類進行了分析,主要是通過GO注釋,以及GO功能注釋后差異蛋白參與的功能的富集分析,以及差異蛋白所富集在的信號通路做圖分析,根據(jù)主要富集的信號通路功能來確定感興趣的蛋白以及信號通路進行下一步分析。相應(yīng)的注釋分析以及富集分析均經(jīng)過費舍爾檢驗來評價。我們將個分組中持續(xù)上調(diào)的差異蛋白進行篩選,通過比對數(shù)據(jù)庫,功能注釋以及富集的通路及功能分析,篩選出有潛力的蛋白富含亮氨酸軟骨蛋白(Chondroadherin CHAD)作為下一步研究的特征性蛋白。并對各組中特征性蛋白CHAD行RT-PCR驗證,CHAD在DHEA+誘導(dǎo)組中在同一時間分組中表達量最高,且在第14天表達量最高,與質(zhì)譜中蛋白含量升高倍數(shù)一致。研究結(jié)論DHEA成骨誘導(dǎo)體系比其他組更明顯促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,并上調(diào)成骨相關(guān)基因;篩選出可能調(diào)控DHEA誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的相關(guān)蛋白分子富含亮氨酸軟骨蛋白(Chondroadherin CHAD),并在基因水平驗證了其存在。根據(jù)KEGG及GO分析,其機制可能是CHAD/JAK/STAT信號通路的激活,并激活下游關(guān)鍵基因干擾素調(diào)節(jié)因子9(IRF9)的表達,最終使DHEA表達促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的效果,從而參與到誘導(dǎo)成骨形成的過程。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

圖 1-1 藥物濃度篩選實驗（MTT 法）：體外檢測干細(xì)胞使用含不同濃度的 DHEA 培養(yǎng)基培養(yǎng)示同一時間點不同濃度檢測細(xì)胞對藥物最適濃度的篩選結(jié)果。Fig 1-1 Drug concentration screening test (MTT method): In vitro detection of stem cells usingdifferent concentrations of DHEA medium culture, showing the same time point of differentconcentrations of cells to detect the optimal concentration of drug screening results3.2 茜素紅染色觀察茜素紅 S 是橙黃色的針狀體。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和1%水溶液 pH2.15。由茜素經(jīng)發(fā)煙硫酸磺化，然后轉(zhuǎn)變?yōu)殁c鹽制得一種蒽醌(Anthraquinone)類的衍生物，是茜素磺酸鈉鹽。茜素紅可成骨細(xì)胞中的鈣鹽鰲和成紅色物，因干細(xì)胞沒有成骨細(xì)胞所特有的成分，因此用茜素紅染色可以評價干細(xì)胞是否成骨分化。通過判斷

圖 1-2 DHEA 組、誘導(dǎo)組及 DHEA+誘導(dǎo)組 4 天、7 天、14 天的茜素紅染色(200×)Fig 1-2 Adenosine red staining of DHEA group, induction group and DHEA+ induction group at da4, 7 and 14 (200×)3.3 堿性磷酸酶染色觀察及細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性檢測堿性磷酸酯酶是一類成骨細(xì)胞分泌，可視為干細(xì)胞成功向成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，利用蛋白酶裂解液將細(xì)胞裂解后，細(xì)胞內(nèi)的酶釋放出來后可高效的針對單酯磷酸并將磷酸基水解，水解磷酸基團后生成磷酸根離子，并在堿性條件下最為有效。該酶是一組同功酶的統(tǒng)稱。經(jīng)過堿性磷酸酯酶的催化可將 BCIP 水解出來的反應(yīng)物繼續(xù)于 NBT 反應(yīng)，生成的四唑硝基藍是一種不溶性的，呈藍紫色的結(jié)晶。根據(jù)結(jié)晶顏色可判斷爬片

RAQ 技術(shù)的脫氫表雄酮(DHEA)促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化機制研究 2015 級碩士學(xué)位論文、誘導(dǎo)組及 DHEA+誘導(dǎo)組在第 4 天的時候并未出現(xiàn)明顯的藍色或者藍色的沉淀，而第 7 天時候除空白組均有 ALP 染色出現(xiàn)，其中 DHEA+誘組染色程度在同一時間點明顯高于其他兩組，且在第 14 天中更為明。細(xì)胞內(nèi) ALP 活性水平如圖所示，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，ALP 的活性均加，其中 DHEA+誘導(dǎo)組活性最高，誘導(dǎo)組次之，其中在第 14 天時候組均呈現(xiàn)出較高的表達。

【參考文獻】

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1 周予婧;王樸;陳紅英;劉遄;季僑丹;陽筱甜;高強;何成奇;;脈沖電磁場對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、成骨分化和Wnt/β-catenin信號通路的影響[J];四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2015年03期

2 鄭潔;瞿茹怡;李圣賢;徐玉梅;陸詠;;體質(zhì)指數(shù)對老年男性骨質(zhì)疏松的影響[J];藥學(xué)服務(wù)與研究;2014年03期

本文編號：2815347