目的類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關節(jié)腫脹及關節(jié)壓痛為特征的慢性全身性自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是指缺乏5,末端和3,末端的共價閉合環(huán)狀新型非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA),研究表明circRNA不僅可作為多種疾病早期診斷和預后判斷的生物學標志物,還可進一步參與疾病發(fā)生發(fā)展過程。本研究旨在借助高通量測序技術(RNA sequencing,RNA-seq)分析RA患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中circRNA及mRNA表達譜差異,并結合生物信息學分析差異表達基因,多樣本臨床驗證并篩選出可作為RA輔助診斷的circRNA分子標志物,進而為RA發(fā)病機制的研究奠定基礎。方法臨床采集4例重癥RA患者(RA組)和3例健康對照者(NC組)的空腹外周血各5ml,EDTA-K_2抗凝,利用人外周血淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離出PBMCs,冷凍保存并送至上海烈冰生物醫(yī)藥科技有限公司,其使用VAHTSTM Total RNA-seq(H/M/R)構建RNA樣本的cDNA文庫,cDNA文庫在IIIumina HiSeq TM2500上進行配對測序,檢測與NC組相比,RA組PBMCs中差異表達的circRNA和mRNA。對差異表達的circRNA進行基于GO(Gene ontology)數據庫的GO顯著性富集分析;對差異表達的mRNA進行基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)數據庫的KEGG Pathway顯著性富集分析。以明顯失調的circRNA為中心構建circRNA-miRNA-mRNA分子調控網絡圖,展現它們之間的相互作用。從顯著差異表達的circRNA中選擇2條上調circRNA和2條下調circRNA,使用實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)在32例RA患者和20例健康對照者中進行臨床驗證。受試者工作曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析已驗證顯著差異表達的circRNA對RA的檢驗效能。利用熒光原位雜交技術(Fluorescence in situ hybridization,FISH)對目標circRNA hsa_circ_0000396進行定位分析。流式細胞術分選和qRT-PCR技術分析與健康對照者相比,RA患者CD3~+T、CD19~+B及CD56~+NK細胞中hsa_circ_0000396的相對頻率。結果RNA-seq結果顯示,RA組和NC組中共有71種顯著差異表達的circRNA,包括41種表達上調circRNA和30種表達下調circRNA;RA組和NC組中共有1078種顯著差異表達的mRNA,包括662種表達上調mRNA和416種表達下調mRNA。GO富集分析表明,差異表達的circRNA涉及的生物過程變化主要針對NOD2信號通路等;涉及的分子功能變化則主要集中在對poly(A)核糖核酸酶的活性調控過程;細胞組成分析顯示差異表達的circRNA大多參與細胞質、線粒體外膜胞質等的組成。KEGG pathway分析表明,差異表達的mRNA主要富集在TNF信號通路和NF-kappaB信號通路。CircRNA-miRNA-mRNA分子調控網絡圖顯示差異表達的circRNA可通過與miRNA相互作用發(fā)揮調控下游靶基因作用。qRT-PCR驗證結果顯示hsa_circ_0000396和hsa_circ_0130438在RA組PBMCs中的表達水平顯著低于NC組(P0.05),與測序結果一致;但hsa_circ_0004442和hsa_circ_0025887在RA組的表達量與NC組相比則無明顯差異(P0.05)。對hsa_circ_0000396和hsa_circ_0130438進行ROC曲線分析,結果顯示,hsa_circ_0000396曲線下面積為0.809,hsa_circ_0130438曲線下面積為0.774,故hsa_circ_0000396對RA診斷具有較高的檢驗效能,更有潛力成為RA診斷分子標志物。故我們選擇hsa_circ_0000396作為目標circRNA進行深入研究,熒光原位雜交技術顯示與大多數的外顯子circRNA一致,hsa_circ_0000396呈現很強的細胞漿定位。qRT-PCR結果顯示,與NC組相比,RA組CD3~+T細胞和CD19~+B細胞中hsa_circ_0000396的表達量明顯下降,而兩組CD56~+NK細胞中hsa_circ_0000396的表達量則無明顯差異。結論證實了RA患者PBMCs中存在顯著差異表達的circRNA和mRNA,這些差異表達基因涉及的通路多與炎癥和轉錄活性有關。揭示了hsa_circ_0000396有望成為RA診斷的生物標志物,并可能參與T、B細胞對RA的調控作用,進而為RA診斷治療及發(fā)病機制的研究提供新的方向。
【學位單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R593.22
【部分圖文】：

圖 1 顯著差異表達 circRNA 分層聚類圖ig.1 The hierarchical clustering of significantly dysregulated circRN3 代表 3 例健康對照者，RA-1、RA-2、RA-3、RA-C 代表析 圖 2 所示的火山圖顯示了 RA 組和 NC 組差異表達或≤-1.0，且 FDR≤0.05 之間的部分是具有統計學差異示表達下調的 circRNA，右側紅色點表示表達上調的

圖 2 火山圖顯示 RA 組和 NC 組差異表達 circRNAs were constructed to demonstrate the significantly dysregulated cRA patients注：FC: fold change; FDR: false discovery rate.果中差異表達的 circRNA 大多來源于外顯子，僅有兩 3 個 circRNA 來源不明，這與之前的研究報道一致。分布于每條染色體，在我們檢測出的差異表達的 ci數目的 circRNA，占比約為 11.1%（圖 3）。

圖 2 火山圖顯示 RA 組和 NC 組差異表達 circRNA Volcano plots were constructed to demonstrate the significantly dysregulated circRNA expresRA patients注：FC: fold change; FDR: false discovery rate.在我們的結果中差異表達的 circRNA 大多來源于外顯子，僅有兩個 circRNA含子，還有 3 個 circRNA 來源不明，這與之前的研究報道一致。且這些差異ircRNA 廣泛分布于每條染色體，在我們檢測出的差異表達的 circRNA 中，上具有最多數目的 circRNA，占比約為 11.1%（圖 3）。

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本文編號：2814751