研究目的:目前公認(rèn)2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種慢性炎癥性疾病,在患者外周血及動(dòng)物模型的肝臟、脂肪、胰腺等組織中均可檢測(cè)到明確的炎癥反應(yīng),炎性細(xì)胞因子的分泌增多加重了 T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。免疫系統(tǒng)異常在T2DM慢性炎癥過(guò)程中扮演了重要角色,淋巴細(xì)胞活化信號(hào)分子家族(signaling lymphocyte activated molecular family,SLAMF)被報(bào)道在多種免疫異常疾病中表達(dá)異常,并影響免疫細(xì)胞分化及功能。然而對(duì)T2DM免疫細(xì)胞表面SLAMF分子的表達(dá)情況未被報(bào)道,且對(duì)于T2DM和炎癥反應(yīng)發(fā)生的具體機(jī)制仍不明確。為探討這一問(wèn)題,本課題以T2DM患者和人源化小鼠高脂模型為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)T2DM患者外周血中免疫細(xì)胞分化及SLAMF分子表達(dá)情況進(jìn)行分析、體外棕櫚酸條件下進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及人源化高脂模型的建立,以期探討免疫系統(tǒng)分化及SLAMF分子表達(dá)對(duì)T2DM慢性炎癥反應(yīng)的作用及其相關(guān)機(jī)制。研究方法:(1)利用流式細(xì)胞分析法對(duì)T2DM患者及健康對(duì)照組(health control,HC)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中T細(xì)胞及其亞群、NK細(xì)胞及其亞群等免疫細(xì)胞比例進(jìn)行分析,并檢測(cè)T細(xì)胞和NK細(xì)胞表面SLAMF分子的表達(dá)情況:(2)利用流式細(xì)胞分析法對(duì)T2DM患者外周血中T細(xì)胞表達(dá)SLAMF3分子及促炎性細(xì)胞因子IFN-y和IL-17的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),分析SLAMF3分子與細(xì)胞因子表達(dá)之間的相關(guān)性;(3)采用流式細(xì)胞分選技術(shù)將SLAMF3high CD4 T細(xì)胞和SLAMF3low CD4 T細(xì)胞分別進(jìn)行分選,在不同濃度抗CD3/CD28單克隆抗體的刺激下進(jìn)行體外擴(kuò)增,觀察兩種細(xì)胞擴(kuò)增情況;(4)應(yīng)用免疫磁珠分選技術(shù)分選臍帶血細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞,在體外給予不同濃度棕櫚酸,在抗CD3/CD28單克隆抗體的刺激下進(jìn)行培養(yǎng),檢測(cè)作用72h后CD4+T細(xì)胞表面SLAMF3分子表達(dá)情況,并將培養(yǎng)后的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分析差異表達(dá)基因的分布及臨床意義;(5)體外培養(yǎng)T細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞,給予不同濃度棕櫚酸,作用72h后檢測(cè)其表面SLAMF3分子表達(dá)情況,棕櫚酸作用體外培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞的同時(shí),給予細(xì)胞不同濃度的PI3K抑制劑(LY294002)或不同濃度的STAT5抑制劑(sc-355979),檢測(cè)作用72h后Jurkat細(xì)胞表達(dá)SLAMF3分子情況;(6)將人胚胎肝臟來(lái)源的CD34+造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)輸給經(jīng)過(guò)1.75Gy輻照的NCG小鼠,同時(shí)對(duì)NCG小鼠進(jìn)行腎被膜下胸腺組織移植,構(gòu)建人源化小鼠模型,在該小鼠模型基礎(chǔ)上進(jìn)行高脂飲食喂養(yǎng),構(gòu)建人源化小鼠高脂模型。人源化構(gòu)建成功后5周對(duì)人源化小鼠分組進(jìn)行高脂飲食喂養(yǎng)或正常飲食喂養(yǎng),每周對(duì)小鼠進(jìn)行體重、隨機(jī)血糖監(jiān)測(cè),每3周進(jìn)行人源化構(gòu)建比例檢測(cè),于高脂飲食喂養(yǎng)后12周對(duì)小鼠進(jìn)行處死。采用血脂檢測(cè)試劑盒進(jìn)行血脂檢測(cè),用流式細(xì)胞分析法檢測(cè)兩組小鼠外周血、肝臟、脾臟、骨髓、胸腺及內(nèi)臟脂肪組織中免疫細(xì)胞重建情況及T細(xì)胞表面SLAMF3分子表達(dá)情況。對(duì)小鼠肝臟、脾臟、胰腺及內(nèi)臟脂肪組織留取病理,進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosi,HE)染色,觀察其組織細(xì)胞形態(tài)、炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況及脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)情況。研究結(jié)果:(1)T2DM患者外周血PBMC中免疫細(xì)胞比例與HCs比較存在異常,表現(xiàn)為CD4T細(xì)胞比例增多、CD8T細(xì)胞比例減少、NKT細(xì)胞比例減少,總NK細(xì)胞比例減低、其中主要表現(xiàn)為CD56dimNK細(xì)胞比例減低。(2)與HCs相比,T2DM患者外周血PBMC中SLAMF3分子MFI在總T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD4T細(xì)胞及NKT細(xì)胞中明顯升高;SLAMF5+CD4T細(xì)胞及SLAMF5+NKT細(xì)胞比例有所升高;SLAMF7分子MFI水平在NKT細(xì)胞中明顯降低。與HCs相比,T2DM患者NK細(xì)胞表面SLAMF3 MFI水平較HCs有所升高;T2DM患者總NK細(xì)胞或CD56dimNK細(xì)胞表達(dá)SLAMF5+細(xì)胞比例明顯增多;總NK細(xì)胞或CD56dimNK細(xì)胞中SLAMF6+細(xì)胞表達(dá)有所下降;總NK細(xì)胞或CD56dim NK細(xì)胞表面SLAMF7分子明顯高表達(dá)。(3)T2DM患者T細(xì)胞表面SLAMF3分子表達(dá)升高與促炎因子IFN-γ和IL-17的產(chǎn)生增多有關(guān),且SLAMF3high CD4 T細(xì)胞對(duì)抗CD3/CD28單克隆抗體的TCR刺激更敏感、更易擴(kuò)增。(4)棕櫚酸可通過(guò)STAT5-PI3K/Akt通路誘導(dǎo)T細(xì)胞表面SLAMF3分子表達(dá)升高,棕櫚酸誘導(dǎo)的人CD4 T細(xì)胞的mRNA測(cè)序差異表達(dá)基因在T2DM及其并發(fā)癥的富集明顯增多;(5)通過(guò)轉(zhuǎn)輸人胚胎肝臟CD34+造血干細(xì)胞、腎被膜下移植胸腺組織給NCG小鼠,聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng),可以建立人源化高脂動(dòng)物模型,高脂喂養(yǎng)后12周其血清中膽固醇和甘油三酯明顯升高、內(nèi)臟脂肪重量明顯增加,但肝臟、脾臟等未見(jiàn)明顯脂肪變性或炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況。流式結(jié)果提示高脂喂養(yǎng)組小鼠外周血和VAT中T細(xì)胞表面SLAMF3表達(dá)水平明顯增高。研究結(jié)論:(1)T2DM患者外周血PBMC中免疫細(xì)胞分化比例與HCs相比存在異常,T細(xì)胞及NK細(xì)胞表面多種SLAMF分子表達(dá)水平不同。(2)T2DM患者T細(xì)胞表面SLAMF3分子表達(dá)升高與促炎因子IFN-γ和IL-17的產(chǎn)生增多及T細(xì)胞擴(kuò)增狀態(tài)相關(guān)。(3)棕櫚酸可通過(guò)活化STAT5-PI3K/Akt通路導(dǎo)致T細(xì)胞表面SLAMF3分子表達(dá)升高,棕櫚酸誘導(dǎo)的人CD4 T細(xì)胞的mRNA測(cè)序差異表達(dá)基因在T2DM及其并發(fā)癥的富集明顯增多。(4)通過(guò)轉(zhuǎn)輸人胚胎肝臟CD34+造血干細(xì)胞、腎被膜下移植胸腺組織給NCG小鼠,聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng),可以建立人源化高脂動(dòng)物模型,高脂可能是人源化小鼠外周血和VAT中T細(xì)胞表面SLAMF3表達(dá)水平升高的主要原因。綜上所述,本課題為T(mén)2DM慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù),證實(shí)了飽和脂肪酸如棕櫚酸對(duì)T細(xì)胞表面SLAMF3表達(dá)的影響可能導(dǎo)致了炎癥反應(yīng)的發(fā)生,提示改變T2DM患者T細(xì)胞表面SLAMF3表達(dá)水平或可作為T(mén)2DM的免疫治療提供了可能的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R587.1
【部分圖文】：

。組織發(fā)生慢性炎癥過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)天然免疫系統(tǒng)及獲得性免疫系統(tǒng)因子的異常分逡逑化，而這些異常分化可能是導(dǎo)致Ｔ２ＤＭ發(fā)生的關(guān)鍵因素［３】。肥胖或Ｔ２ＤＭ過(guò)程逡逑中會(huì)出現(xiàn)許多免疫系統(tǒng)及其細(xì)胞因子的異常分泌（圖２．１），然而Ｔ２ＤＭ慢性炎逡逑癥的發(fā)生與免疫異常的相關(guān)機(jī)制仍不明確。逡逑

證明棕櫚酸通過(guò)ＴＬＲ４介導(dǎo)的ＮＫ－ｋＢ炎癥通路的活化引起了血管內(nèi)皮炎癥反逡逑應(yīng)，從而與心臟冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)病相關(guān)［１Ｇ４］。棕櫚酸可以通過(guò)多種代謝途徑從逡逑而影響胰島素信號(hào)通路導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生（圖２．２）。首先，增加的棕櫚酸逡逑發(fā)揮脂毒性，使甘油二酯（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ，ＤＡＧ）和神經(jīng)酰胺的水平增加，ＤＡＧ逡逑的增加使蛋白激酶Ｃ邋（ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ邋Ｃ，ＰＫＣ）活化，從而通過(guò)磷酸化絲氨酸殘逡逑基上的胰島素受體底物（ｉｎｓｕｌｉｎ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，邋ＩＲＳ）邋－１和活化ＮＫ－ｋＢ通路逡逑影響胰島素代謝通路［１Ｑ５］。其次，棕櫚酸的積聚損傷了線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，逡逑導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而促進(jìn)ＮＦ－ｋＢ通路的活化以及活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｏｘｙｇｅｎ逡逑ｓｐｅｃｉｅｓ，邋ＲＯＳ）產(chǎn)物的增多，進(jìn)一步加重胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)。與此同時(shí)，棕逡逑梢酸可以通過(guò)激活膜表面受體（如Ｔｏｌｌ樣受體４，邋Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋４，邋ＴＬＲ４）

統(tǒng)計(jì)圖及流式圖（Ｅ）邋＊＊，Ｐ＜０．０１；ｎｓ，無(wú)顯著差異。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１邋Ｔｈｅ邋ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ邋ｏｆ邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ邋（Ａ）邋ａｎｄ邋ｉｔｓ邋ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ邋（Ｂ，邋Ｃ，邋Ｄ）邋ｉｎ逡逑ＰＢＭＣ邋ｉｎ邋ＨＣｓ邋ａｎｄ邋Ｔ２ＤＭ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｐｒｏｆｉｌｅｓ邋ｏｆ邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑ａｎｄ邋ｉｔｓ邋ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ邋（Ｅ）．邋＊＊，邋Ｐ＜０．０１，邋ｎｏ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．逡逑ＮＫ細(xì)胞在Ｔ２ＤＭ患者外周血中同樣存在表達(dá)異常。通過(guò)分析ＮＫ細(xì)胞在逡逑外周血中所占比例，可得出，Ｔ２ＤＭ患者外周血中ＣＤ５６＋總ＮＫ細(xì)胞表達(dá)明顯逡逑下降（圖３．２Ａ，Ｃ），且主要表現(xiàn)為ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細(xì)胞亞群比例的減低（圖３．２Ｂ，逡逑Ｃ）0逡逑Ａ邐Ｂ邐0邋ｈｃ逡逑１５０－，邐0邋Ｔ２ＤＭ逡逑４0ｎ邐邐邐逡逑＊逡逑（Ａ邐邐逡逑ｊｎ邋３０＇邐0邐｜邋１００－邐．邐＾邐＾逡逑１２0．邋ｗ邋。。邋ｉ邋ｒｒ。。霧邋１逡逑

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1 周彤;2型糖尿病患者免疫細(xì)胞表面SLAMF分子異常表達(dá)與免疫病理機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2809571