【摘要】：【目的】探討3T3-L1脂肪細(xì)胞生長激素受體(growth hormone receptor,GHR)對游離脂肪酸(free fat acid,FFA)誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和分泌的影響及其作用機制�！痉椒ā�(1)誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化,待分化呈90%成熟脂肪細(xì)胞表型,采用siLentFect脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)siRNA沉默脂肪細(xì)胞GHR的表達(dá)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后,Western blot檢測si RNA-GHR的沉默效率。(2)分別用0mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1mM FFA處理3T3-L1脂肪細(xì)胞30min、60min、120min、240min,MTT試劑盒檢測各組細(xì)胞活力變化,分析計算FFA最佳處理時間和濃度。(3)熒光實時定量PCR技術(shù)檢測沉默GHR表達(dá)對FFA誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1α(monocyte chemoattractant protein-1α,MCP-1α)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)mRNA表達(dá)水平;ELISA檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌水平。(4)采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析沉默GHR表達(dá)對FFA誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。(5)Western blot檢測沉默GHR表達(dá)對FFA誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞NF-κB炎癥信號通路分子表達(dá)的影響。(6)通過特異性激動劑Forskolin(FK)或抑制劑Okadaic Acid(OA)分別增強或抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的活性,采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性、Western blot檢測NF-κB炎癥信號通路分子的表達(dá)水平,觀察沉默GHR表達(dá)對FFA激活3T3-L1脂肪細(xì)胞NF-κB炎癥信號通路的影響。【結(jié)果】(1)特異性siRNA-GHR轉(zhuǎn)染3T3-L1脂肪細(xì)胞后,siRNA-GHR組GHR的表達(dá)水平較siRNA-control組下降85.1%(P0.05,差異具有顯著性)。(2)0.05mM和0.1mM FFA分別處理細(xì)胞30min、60min、120min、240min及0.5mM FFA處理細(xì)胞30min、60min、120min后,細(xì)胞活力較對照組均無明顯變化(P0.05,差異無顯著性);0.5mM FFA處理細(xì)胞240min及1.0mM FFA處理細(xì)胞30min、60min、120min、240min后,細(xì)胞活力較對照組明顯下降(P0.05,差異具有顯著性)。(3)3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)0.5mM FFA處理30 min、60 min、120 min后,TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1α、MIP-1α基因mRNA的表達(dá)水平較對照組顯著升高(P0.05,差異具有顯著性)。沉默3T3-L1脂肪細(xì)胞GHR的表達(dá)后,FFA誘導(dǎo)細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1α、MIP-1α基因mRNA的表達(dá)水平較對照組顯著降低(P0.05,差異具有顯著性)。(4)0.5mM FFA處理細(xì)胞30min、60min、120min后,細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平較對照組顯著升高(P0.05,差異具有顯著性);沉默3T3-L1脂肪細(xì)胞GHR的表達(dá)后,細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的水平較對照組顯著降低(P0.05,差異具有顯著性)。(5)FFA誘導(dǎo)細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性增強。隨著FFA處理濃度的增加,NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性逐漸增強(P0.05,差異具有顯著性);而沉默GHR的表達(dá)能夠顯著降低FFA誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄激活(P0.05,差異具有顯著性)。(6)3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)0.5mM FFA處理120min后,炎性激酶IKKβ和NF-κB磷酸化水平明顯增加;而沉默脂肪細(xì)胞GHR的表達(dá)可顯著降低磷酸化IKKβ和NF-κB p65的過度表達(dá)(P0.05,差異具有顯著性)。(7)0.5mM FFA分別處理細(xì)胞30min、60min、120min后,PP2Ac蛋白表達(dá)水平均無明顯變化,但PP2Ac活性受到明顯抑制(P0.05,差異具有顯著性);而沉默GHR表達(dá)能夠顯著改善FFA對細(xì)胞PP2A活性的抑制作用(P0.05,差異具有顯著性)。(8)沉默GHR表達(dá)能夠抑制FFA誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥信號通路相關(guān)蛋白的活化。且PP2A激活劑FK能夠進(jìn)一步增強此效應(yīng),但PP2A抑制劑OA能夠部分逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。【結(jié)論】沉默GHR表達(dá)通過PP2A/IKKβ/NF-κB信號通路拮抗FFA誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)和分泌。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R589.2
【圖文】：

第 4 章 實驗結(jié)果第 4 章 實驗結(jié)果HR 對 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 GHR 的沉默效R 對 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 GHR 的沉默效率，實驗將 siRNA duplex-GHR（si-GHR）或 scramble n 脂肪細(xì)胞 24 h，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，結(jié)果如圖 4.1 所示，與 si-Ctrl 組比較，siRNA-G<0.05，差異具有顯著性）。

圖 4.2 FFA 處理對 3T3-L1 脂肪細(xì)胞活力的影響（* P<0.05，與處理時間相同，但無 FFA 處理的細(xì)胞組比較，n=3）.3 沉默GHR表達(dá)對FFA誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子mRN達(dá)的影響將 si-GHR 或 si-Ctrl 轉(zhuǎn)染 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 24 h 后，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，用 0.5mM FFA 分別處理 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 30min,60min,120min 后用熒光實時定量 PC術(shù)檢測炎癥細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1α、MIP-1α mRNA 表達(dá)的變化。如圖 4.3 所示，隨著 FFA 處理時間的延長 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 IL-1β（圖 4.3A）、TN圖 4.3B）、IL-6（圖 4.3C）、MCP-1α（圖 4.3D）、MIP-1α（圖 4.3E）基因 mRNA達(dá)水平較對照組顯著增高（P<0.05，差異具有顯著性）。沉默 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 G表達(dá)后，F(xiàn)FA 誘導(dǎo)的細(xì)胞 TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1α、MIP-1α基因 mRNA 的表

FFA 誘導(dǎo) 3T3-L1 脂肪細(xì)胞炎癥因子 IL-1β（A）、TN基因 mRNA 表達(dá)的影響（* P<0.05，與 Ctrl 組相應(yīng)時間點數(shù)據(jù)比較；n=3）

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本文編號：2804528