【摘要】：第一部分NUCB2基因敲除對大鼠肝糖代謝的影響與機制研究目的:探討NUCB2基因敲除對高脂喂養(yǎng)大鼠肝糖代謝的影響,并初步研究NUCB2對肝糖代謝的影響機制。方法:將由雜合子與雜合子繁殖的同窩6周齡野生型(WT)與純合子(NUCB2~(-/-))健康雄性大鼠,分別進行普食(ND)和高脂(HFD)喂養(yǎng),即分為ND-WT、ND-NUCB2~(-/-)、HFD-WT、HFD-NUCB2~(-/-)四組,喂養(yǎng)12周并每周測定體重,12周后分別測定肛溫、攝食、空腹與餐后血糖,并進行GTT、ITT和高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗,分析NUCB2基因敲除對大鼠肝糖代謝的影響。將四組大鼠的肝組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析,分析NUCB2基因敲除對糖代謝相關(guān)因子的影響,對產(chǎn)生表達變化的因子進行進一步的Q-PCR和Western blot以證實其檢測結(jié)果。再檢測各組大鼠肝組織mRNA與蛋白表達水平,進行Q-PCR和Western blot實驗,分析糖異生相關(guān)因子(PEPCK、G6Pase)、糖酵解相關(guān)因子(Gck、PKLR)、糖原合成相關(guān)因子(GSK3β)的表達變化情況,檢測糖代謝信號通路IR/IRS/AKT的表達差異。結(jié)果:在分組喂養(yǎng)12周后,HFD組NUCB2~(-/-)大鼠的體重、攝食量較WT增加,肛溫則降低(P0.05或P0.01);FBG、PBG、GTT、ITT與高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗結(jié)果均顯示NUCB2基因敲除組較對照組胰島素抵抗增加(P0.05或P0.01);肝組織的轉(zhuǎn)錄組測序分析顯示NUCB2基因敲除大鼠較對照組的糖有氧氧化相關(guān)基因PDK4表達增加;NUCB2基因敲除大鼠較對照組肝糖異生相關(guān)因子PEPCK、G6Pase表達增加,糖酵解相關(guān)因子Gck、PKLR與糖原合成相關(guān)因子GSK3β表達降低,IR/IRS/AKT信號通路的磷酸化水平降低。結(jié)論:NUCB2基因敲除可增加大鼠高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗。第二部分NUCB2對肝細(xì)胞糖代謝的影響與機制研究目的:探討NUCB2對大鼠原代肝細(xì)胞糖代謝的影響與機制。方法:用游離脂肪酸(FFAs)對NUCB2-/-和野生型大鼠原代肝細(xì)胞進行誘導(dǎo),造成肝細(xì)胞胰島素抵抗模型。利用海馬XF糖酵解速率分析(Glycolytic Rate Assay,GRA)分析NUCB2-/-和WT大鼠原代肝細(xì)胞在糖酵解上的差異,通過細(xì)胞線粒體壓力測試(Cell Mito Stress Test,MST)分析各組細(xì)胞有氧氧化能力的不同。再檢測各組原代肝細(xì)胞m RNA與蛋白表達,進一步分析NUCB2-/-和對照組之間PDK4、PEPCK、G6Pase、Gck、PKLR、p-GSK3β等的表達差異,驗證NUCB2在肝細(xì)胞中對IR/IRS/AKT的表達活性影響。結(jié)果:在NUCB2-/-和WT大鼠原代肝細(xì)胞成功誘導(dǎo)胰島素抵抗模型。在海馬XF細(xì)胞線粒體壓力測試(Cell Mito Stress Test,MST)和糖酵解速率分析(Glycolytic Rate Assay,GRA)實驗中發(fā)現(xiàn)NUCB2-/-原代肝細(xì)胞較對照組的有氧氧化能力與糖酵解均降低(p0.05或p0.01)。在進一步的m RNA與蛋白表達檢測中,NUCB2-/-大鼠原代肝細(xì)胞較對照組PEPCK、G6Pase、PDK4表達增加,Gck、PKLR、p-GSK3β表達降低,IR/IRS/AKT信號通路的磷酸化水平降低。結(jié)論:NUCB2基因敲除可降低肝細(xì)胞有氧氧化與糖酵解能力,增加肝細(xì)胞FFAs誘導(dǎo)的胰島素抵抗。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R589
【圖文】：

計軟件 SPSS7.0 分析結(jié)果，以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示；采用 t 檢驗進行組間分析，P<0.05 有意義。果因敲除大鼠的鑒定分型賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建引入 NUCB2+/-大鼠，在重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動養(yǎng)，通過一對一繁殖，半定量 PCR 分型鑒定子代，采用兩組鑒定引物。物鑒定結(jié)果中，只有一條 630bp 的條帶為陽性純合子（-/-）或雜合子（+/-1335bp 的 WT 鏈可能擴增不出；只有一條 1335bp 的條帶為 WT（+/+）335bp 和 630bp 條帶的為+/-。第二組引物鑒定結(jié)果中，只有一條 672bp 條+或+/-，無條帶為-/-。鑒定結(jié)果如圖 3.1 所示。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 12 周的大鼠基礎(chǔ)指標(biāo)圖所示，6 周齡的野生型和 NUCB2-/-大鼠在經(jīng)過 12 周的飲食誘重明顯高于 ND 組。從第 10 周開始，HFD 組中 NUCB2-/-鼠的體5 或 P<0.01)，如圖 3.2.1。在造模滿 12 周時，NUCB2-/-大鼠與造重改變較 WT 組大(P<0.01)，如圖 3.2.2。在普食組中，NUCB2-/- 12 周后的體重略高于 WT 大鼠，但是該差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 3.2.2 體重改變Figure 3.2.2 Body weight change **p<0.01 vs. HFD-WT型和 NUCB2-/-大鼠在造模 12 周完成后，攝食測量中，高脂（HF鼠的攝食高于 WT 大鼠(P<0.05)，如圖 3.2.3 所示，而普食組無的肛溫測量中，NUCB2-/-大鼠與 WT 大鼠相比降低(P<0.05)，如圖食組無明顯差異。

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本文編號：2801797