【摘要】：第一部分MuSK-mCherry融合熒光蛋白的構(gòu)建及對重癥肌無力患者M(jìn)uSK抗體的檢測目的：構(gòu)建肌肉特異性激酶(MuSK)與紅色熒光蛋白(mCherry)的重組融合蛋白(MuSK-mCherry),并作為抗原用于重癥肌無力(MG)患者血清中的MuSK抗體的檢測。方法：首先通過PCR擴(kuò)增pRSET-B載體中的mCherry基因,擴(kuò)增后的mCherry基因經(jīng)加A尾后克隆至T載體(pGEM-T Easy Vector),并將克隆載體轉(zhuǎn)化至E coli DH5α細(xì)胞株。純化提取質(zhì)粒經(jīng)Age Ⅰ酶切后,克隆至含MuSK細(xì)胞外區(qū)基因的載體pMT/BiP/V5-His (MuSK)上,連接mCherry基因與人MuSK細(xì)胞外區(qū)第22～452位氨基酸肽段基因,并將連接基因轉(zhuǎn)化至E coli DH5a細(xì)胞株,以構(gòu)建MuSK-mCherry融合熒光蛋白基因。其次,將制備的上述重組載體轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞,采用共聚焦顯微鏡檢查表達(dá)出的MuSK-mCherry融合熒光蛋白。最后,以MuSK-mCherry融合蛋白檢測MG患者血清中MuSK抗體。結(jié)果：成功地構(gòu)建了MuSK-mCherry融合蛋白基因,并得到了表達(dá)。經(jīng)對已知MuSK抗體陽性的MG患者血清中的MuSK抗體的檢測證實(shí),構(gòu)建的MuSK-mCherry融合蛋白在熒光免疫沉淀試驗(yàn)中可以檢測到MuSK抗體。結(jié)論：以MuSK細(xì)胞外肽段與mCherry構(gòu)建的融合熒光蛋白作為抗原,可以用于MG患者血清中的MuSK抗體的檢測。第二部分rapsyn基因外顯子區(qū)多態(tài)性與重癥肌無力相關(guān)性研究目的：研究重癥肌無力(MG)與突觸受體相關(guān)蛋白(rapsyn)外顯子基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)之間的相關(guān)性。方法：采用PCR方法擴(kuò)增MG患者組(132例)以及正常對照組(153例)外周血中提取的DNA中rapsyn基因的8個(gè)外顯子,并測序。測序結(jié)果與NCBI SNPs數(shù)據(jù)庫中野生型rapsyn基因序列(GenBank No. Z33905)進(jìn)行比較,分析rapsyn基因8個(gè)外顯子區(qū)SNPs。運(yùn)用SHEsis在線軟件進(jìn)行等位基因、基因型頻率計(jì)算、Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn),進(jìn)行病例-對照關(guān)聯(lián)分析,查找rapsyn基因突變位點(diǎn)以及MG臨床癥狀與rapsyn基因突變之間的相關(guān)性。結(jié)果：rapsyn基因的第1、2、4、5、6、7、8等7個(gè)外顯子測序結(jié)果與野生型基因序列吻合,未發(fā)現(xiàn)有基因突變。第3外顯子中發(fā)現(xiàn)新SNP:L222R[CTGCGG(2)]或T665G。SNP L222R等位基因頻率和基因型頻率在患者組和對照組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P0.05),具有群體代表性。G等位基因頻率在患者組和對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),3種基因型TT、TG、GG在患者組(42.4%V48.5%V9.1%)和對照組(49.0%V33.3%V17.6%)存在顯著性差異(P0.05),并且攜帶GG基因型對照組顯著高于患者組(P0.05),表現(xiàn)為隱性模型特征。結(jié)論：rapsyn基因第三外顯子L222R (T665G)是MG新的SNP,該SNP與MG遺傳易感性存在相關(guān)性;G等位基因可能是MG的保護(hù)因子。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R746.1

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本文編號(hào)：2801757