發(fā)布時間：2020-08-21 21:43

【摘要】：目的1.體外分離培養(yǎng)多囊卵巢綜合征(PCOS)和非PCOS患者黃素化顆粒細胞并用卵泡刺激素受體(FSHR)免疫熒光鑒定;2.探討二甲雙胍(Met)對PCOS黃素化顆粒細胞胰島素受體底物-1(IRS-1)及p-ser307-IRS-1的信使核糖核酸(m RNA)及蛋白表達水平的影響。方法分離純化體外培養(yǎng)的PCOS和非PCOS組黃素化顆粒細胞用FSHR免疫細胞化學(xué)染色鑒定;添加Met處理培養(yǎng)為實驗組,添加類胰島素生長因子-1(IGF-1)為陽性對照組,15%FBS-M199培養(yǎng)基中加入與Met等量PBS培養(yǎng)為陰性對照組;通過RT-PCR和real-time PCR檢測分析IRS-1m RNA的表達,細胞免疫熒光化學(xué)方法定性和Western-Blot定量檢測分析IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表達。SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理如果p0.05表示差異有顯著意義。結(jié)果1.FSHR蛋白免疫細胞化學(xué)染色是鑒定顆粒細胞的特異性標記物,FSHR陽性染色定位于細胞胞漿和細胞膜,呈綠色熒光,細胞核呈藍色熒光,鏡下可見FSHR的陽性率大于95%;2.RT-PCR法擴增出IRS-1的片段大小為134bp,real-time PCR分析結(jié)果顯示添加Met對PCOS組黃素化顆粒細胞IRS-1 m RNA表達顯著下調(diào),與陽性及陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);3.細胞免疫熒光化學(xué)檢測IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白陽性表達定位在顆粒細胞細胞質(zhì);4.Western-blot檢測Met作用24h后卵巢黃素化顆粒細胞IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),灰度值分析結(jié)果顯示PCOS組卵巢黃素化顆粒細胞IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表達高于非PCOS組,添加Met組作用24h后PCOS組黃素化顆粒細胞IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表達較非PCOS組顯著性下降(p0.05)。結(jié)論1、FSHR蛋白免疫熒光化學(xué)染色陽性率大于95%,卵泡液分離黃素化顆粒細胞培養(yǎng)的純度達到95%以上2、PCOS患者卵巢顆粒細胞IRS-1及其磷酸化表達上升3、Met降低PCOS患者卵巢顆粒細胞IRS-1及其磷酸化的表達
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R711.75
【圖文】：

圖 1 胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖Figure1.Insulin Signaling Pathway有研究【7】發(fā)現(xiàn) PCOS 的 IR 不僅存在于脂肪細胞、肝細胞、骨骼肌細胞等胰島素經(jīng)典靶細胞，也存在于某些非經(jīng)典靶細胞,成纖維細胞和紅細胞，甚至卵巢顆粒細胞等。PCOS 患者組織和細胞因為存在 InsR 活性低下、IRS-1 磷酸化表達異常、細胞膜糖轉(zhuǎn)運蛋白-4（GLuT4）表達低于正常等信號因子異常，從而引起 IR，導(dǎo)致葡萄糖攝取率下降【6】。PCOS 患者的卵巢黃素化顆粒細胞，通過胰島素增敏劑(二甲雙胍 Metformin、Met)可以糾正細胞糖原胰島素合成抵抗狀態(tài)，【7】已被研究證明。體外培養(yǎng)的 PCOS 卵巢黃素化顆粒細胞，胰島素外源刺激減少葡萄糖代謝產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生，增加丙酮酸消耗，提示卵巢顆粒細胞胰島素的作用機制受損【8】。1．PCOS 與 IR

素抵抗【17】。Met 直接作用于卵巢的卵泡膜顆粒細胞，合成類固醇激激素的產(chǎn)生；激活 PCOS 外周組織細胞的胰島素敏感性，降低血清胰制抗氧化劑誘導(dǎo)高雄激素合成而降低雄激素水平。研究報道：正常培養(yǎng)時添加 Met，抑制顆粒細胞分泌雄烯二酮 A2、雌二醇（E2）和孕的卵泡膜腫瘤細胞體外培養(yǎng)基中加入 50uMol 的 Met 能夠抑制（A2）的膜細胞雄激素合成酶 CYP17mRNA 及其蛋白的表達[18]。Met 上調(diào)信號傳導(dǎo)分子磷酸化蛋白激酶（AKT）和下調(diào)促有絲分裂激活蛋蛋白的表達，促進顆粒細胞增殖，減少凋亡。培養(yǎng)時添加 Met（10卵巢的顆粒細胞 E2和 P 的分泌，降低類固醇激素酶的合成【20】。由上AMPK1 信號傳導(dǎo)通路降低類固醇激素的合成，而不完全依賴于胰島見圖 2）。

二甲雙胍對卵巢黃素化顆粒細胞 IRS-1 及其磷酸化表達的影響檢測.1 實驗分組PCOS 患者和非 PCOS 患者卵巢黃素化顆粒細胞分別體外培養(yǎng)：實驗組：細胞培養(yǎng)至 2h 后貼壁生長時添加 Met 100umol/L；陽性對照組：細胞培養(yǎng)至 2h 后貼壁生長時添加添加 IGF-1 0.1mg/ml；陰性對照組：細胞培養(yǎng)至 2h 后貼壁生長時添加與藥物等量 1×PBS100uL。體外分離所得人卵巢黃素化顆粒細胞用于細胞免疫熒光檢測 IRS-1 及 p-IRS-達的細胞進行細胞爬片培養(yǎng)；剩余細胞以相應(yīng)密度接種于六孔板中，用于 RT- Western-blot 檢測黃素化顆粒細胞中 IRS-1 及 p-IRS-1 的表達；所有細胞按實驗養(yǎng) 24h 后進行相關(guān)檢測。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2799895